Una tecnica di colorazione in immunofluorescenza per rilevare la neurogenesi dell'ippocampo adulto

Abstract

Fonte: Ansorg, A., et al. Immunoistochimica e marcatura multipla con anticorpi della stessa specie ospite per studiare la neurogenesi dell'ippocampo adulto. J. Vis. Exp. (2015)

Il video illustra un metodo di colorazione in immunofluorescenza utilizzato per esaminare la neurogenesi nell'ippocampo adulto. Inizialmente, una sezione cerebrale di topo viene sottoposta a trattamento con anticorpi primari diretti contro le proteine marcatrici associate alla neurogenesi nelle cellule progenitrici neuronali. Successivamente, viene marcato con anticorpi secondari marcati con fluorofori. La sezione cerebrale viene quindi osservata al microscopio confocale per distinguere vari sottotipi di cellule progenitrici, in base ai modelli di espressione di distinte combinazioni di proteine marcatrici.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Preparazione dei tessuti

1. Preparare il 4% di formaldeide in tampone fosfato 0,1 M pH 7,4 il giorno prima della perfusione. Conservare a 4 °C.
2. Perfondere transcardialmente i topi profondamente anestetizzati (isoflurano al 3,5%) attraverso il ventricolo sinistro con 10 ml di soluzione salina tamponata con fosfato ghiacciato (PBS), quindi con 40 ml di formaldeide ghiacciata (portata 5 ml/min). Sezionare il cervello e post-fissare nello stesso fissativo per 24 ore a 4°C.
3. Trasferire il cervello consecutivamente in saccarosio al 10% (24 ore a 4°C) e al 30% (fino a quando il cervello non affonda, circa 48 ore). Per il congelamento, immergere lentamente il cervello crioprotetto in isopentano a -25 °C fino a quando non emergono bolle dal tessuto. Conservare a -80 °C.
4. Tagliare sezioni coronali di 40 μm di spessore su un microtomo di congelamento (temperatura del blocco da -25 a -16 °C). Trasferire in sequenza le sezioni in una soluzione antigelo contenente pozzetti di una piastra di coltura cellulare a 24 pozzetti (vedere Figura 1). Conservare a -20 °C.

2. Immunocolorazione

NOTA: Le sezioni vengono elaborate in modo flottante, solitamente in piastre a 6 pozzetti dotate di una piastra di supporto e inserti in rete. In via eccezionale, il blocco, l'incubazione degli anticorpi e le reazioni del complesso avidina-biotina (ABC) vengono eseguite in piastre da 12 o 24 pozzetti senza inserti a rete (da 0,5 a 1 ml per pozzetto è sufficiente, a seconda del numero di fette che devono essere colorate). Durante questi passaggi, trasferire le sezioni con l'aiuto di una spazzola fine (risciacquare con ogni nuova soluzione). Tutte le incubazioni vengono effettuate con agitazione continua (max 150 giri/min).

1. Immunoistochimica (metodo ABC)
   1. Trasferire le sezioni dall'antigelo alla soluzione salina tamponata (TBS) e risciacquare abbondantemente (una volta O/N a 4 °C, 5 volte a temperatura ambiente [RT] per 10 minuti ciascuna) per rimuovere completamente l'antigelo.
   2. Per estinguere l'attività endogena della perossidasi, incubare per 30 minuti in 1,5% H₂O₂ in TBS-Tween 20 (TBS-T). Prestare attenzione alle bolle e immergere nuovamente le sezioni, se necessario. Risciacquare 3 volte in TBS per 15 minuti ciascuna.
   3. Opzionale: nel frattempo, preriscaldare una camera di riscaldamento e 2 N HCl a 37 °C. Per denaturare il DNA, incubare le sezioni per 30 minuti a 37 °C in HCl 2 N. Separare delicatamente le sezioni con l'aiuto di un pennello.
   4. Opzionale: Neutralizzare le sezioni per 10 minuti in tampone borato 0,1 M pH 8,5, RT. Durante il trasferimento, tamponare brevemente gli inserti in rete contenenti le sezioni su un tovagliolo di carta per rimuovere i residui di HCl. Risciacquare 2 volte in TBS per 15 minuti ciascuna.
   5. Incubare in TBSplus per permeabilizzare il tessuto e bloccare i siti di legame degli anticorpi aspecifici per 1 ora a RT.
   6. Incubare in anticorpo primario diluito in TBSplus, O/N a 4 °C. Sciacquare 3 volte in TBS per 15 minuti ciascuna.
   7. Incubare in anticorpo secondario biotinilato diluito in TBSplus per 3 ore a RT. Sciacquare 3 volte in TBS per 15 minuti ciascuna. Nel frattempo...
   8. Preparare il complesso ABC secondo il protocollo del produttore (1% A + 1% B in TBS-T). Lasciare riposare per 30 minuti a RT prima dell'uso. Incubare le sezioni nel reagente AB per 1 ora a RT. Sciacquare 3 volte in TBS per 15 minuti ciascuna.
   9. Preparare 50 ml di 3,3′-diaminobenzidina (DAB) 0,5 mg/ml in TBS-T per piastra a 6 o 12 pozzetti, dividere in due metà e pipettare rispettivamente 4 ml o 2 ml per pozzetto. Trasferire le sezioni nella soluzione DAB (ATTENZIONE! Il DAB è tossico. Seguire la scheda di sicurezza specifica fornita dal fornitore, ad esempio, indossare un camice da laboratorio e guanti e utilizzare una cappa chimica).
   10. Aggiungere 0,5 ml di 1% di H₂O₂ ai restanti 25 ml di soluzione DAB, mescolare e pipettare volumi equivalenti come sopra in ciascun pozzetto per avviare la reazione della perossidasi. Incubare per 12 min. Risciacquare 3 volte in TBS per 15 minuti ciascuna.
   11. Montare le sezioni su vetrini in gelatina e asciugare all'aria O/N. Vetrino coprioggetti con mezzo di montaggio permanente.
   12. Opzionale: Contromacchia prima di posizionare il vetrino coprioggetti.
       nota: Se il rapporto segnale/rumore è basso a causa dell'elevato fondo di fondo, ripetere il trattamento con H₂O₂ dopo l'incubazione con il reagente AB (passaggio 2.1.8).
2. Immunofluorescenza multipla
   1. Immunofluorescenza multipla singola o simultanea
      1. Trasferire le sezioni dall'antigelo al TBS e risciacquare abbondantemente (una volta O/N a 4 °C, 5 volte a RT per 10 minuti ciascuna) per rimuovere completamente l'antigelo.
      2. Opzionale: come passaggi 2.1.3 - 2.1.4.
      3. Incubare in TBSplus per permeabilizzare il tessuto e bloccare i siti di legame degli anticorpi non specifici, 1 ora a RT.
      4. Incubare in un cocktail di anticorpi primari (ad es. α-BrdU di ratto (bromodeossiuridina), cavia α-DCX (doppia cortina), α-GFP di capra (proteina fluorescente verde)) diluito in TBSplus, O/N a 4°C. Sciacquare 3 volte in TBS per 15 minuti ciascuna.
      5. Incubare in un cocktail di anticorpi secondari coniugati con fluorocromo (ad es. Rhodamine Red α-rat, Alexa-647 α-cavia, Alexa-488 α-capra; tutti derivati da asino) diluiti in TBSplus, 3 ore a RT o O/N a 4 °C. D'ora in poi proteggi le sezioni dalla luce. Risciacquare 3 volte in TBS per 15 minuti ciascuna.
      6. Montare le sezioni sui vetrini in gelatina e asciugare all'aria per una notte (O/N). Vetrino coprioggetti con mezzo di montaggio acquoso.
   2. Immunofluorescenza multipla sequenziale con anticorpi primari della stessa specie ospite
      1. Come passaggi 2.2.1.1 - 2.2.1.3.
      2. Incubare nel primo anticorpo primario (ad es. α antigene A di coniglio), O/N a 4 °C. Sciacquare 3 volte in TBS e una volta in TBS-T per 10 minuti ciascuna.
      3. Incubare nel primo anticorpo secondario coniugato con fluorocromo (ad es. Rhodamine Red-conj. asino α-coniglio), 3 ore RT. D'ora in poi, proteggi le sezioni dalla luce. Risciacquare 3 volte in TBS e una volta in TBS-T per 10 minuti ciascuna.
      4. Incubare in siero normale al 10% dello stesso ospite degli anticorpi primari (ad es. siero di coniglio) per 3 ore di RT per saturare i paratopi aperti sul primo anticorpo secondario. Risciacquare 3 volte in TBS e una volta in TBS-T per 10 minuti ciascuna.
      5. Incubare in TBSplus con 50 μg/ml di frammenti di Fab monovalenti non coniugati diretti contro l'ospite degli anticorpi primari (ad es. IgG di α-coniglio (H+L)) per coprire gli epitopi che potrebbero essere riconosciuti dal secondo anticorpo secondario, O/N a 4 °C.
      6. Risciacquare almeno 3 volte in TBS e una volta in TBS-T per 10 minuti ciascuna. Durante il trasferimento, tamponare brevemente gli inserti in rete contenenti le sezioni su un tovagliolo di carta per rimuovere eventuali residui di Fab.
      7. Incubare nel secondo anticorpo primario (ad es. α-antigene B di coniglio), O/N a 4 °C. Sciacquare 3 volte in TBS e una volta in TBS-T per 10 minuti ciascuna.
      8. Incubare in un secondo anticorpo secondario coniugato con fluorocromo (ad es. Alexa-488-conj. asino α-coniglio), 3 ore RT. Sciacquare 3 volte in TBS per 15 minuti ciascuna, montare e vetrino coprioggetti come sopra.
         nota: Per marcare gli antigeni con anticorpi di diverse specie ospiti, aggiungerli al passaggio 2.2.2.2 e i rispettivi anticorpi secondari al passaggio 2.2.2.3.

Risultati

Figura 1. Illustrazione schematica del trasferimento di fette di microtomo in una piastra a 24 pozzetti. Inizia da A1 e posiziona le fette successive nella riga A; dopo A6, vai alla riga B successiva e così via. Al raggiungimento di D6, tornare ad A1 e continuare. Questa disposizione delle fette consente la quantificazione di ogni^ennesima sezione di un intero cervello. Per la quantificazio...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Preparazione dei tessuti
Isoflurano-Actavis	Piramal Sanità	700211
Paraformaldeide in polvere (PFA)	Riedel-De Häen	Codice: 16005	tossico, infiammabile
Pompa di perfusione PD5206	Strumenti Heidolph	Codice: 523-52060-00
Tubo da laboratorio Masterflex Tygon, Ø 0,8 mm	Thermo Fischer Scientific	Codice 06409-13
Ago di alimentazione, dritto, 21 G, 1,75 mm punta a oliva, 40 mm	Agnthos	Ore 1036
Microtomo di congelamento Microm HM 400	Thermo Fischer Scientific
Piastre multipozzetto per colture cellulari a 24 pozzetti	Greiner Bio-One	Codice 662160
Immunoistochimica
Tefal vitacuisine vaporiera	Tefal	VS 4001
Inserti in membrana in rete di poliestere Netwell da 24 mm	Corning	Telefono 3479	Precaricato in piastre di coltura a 6 pozzetti
Inserti in membrana in rete di poliestere Netwell da 15 mm	Corning	Telefono 3477	Precaricato in piastre di coltura a 12 pozzetti
Kit di supporto a 6 pozzetti in plastica Netwell	Corning	Codice: 3521	per inserti in membrana a rete di poliestere da 24 mm
Kit portante Netwell in plastica a 12 pozzetti	Corning	3520	per inserti in membrana in rete di poliestere da 15 mm
Kit Vectastain Elite ABC	Laboratori Vector	PK-6100
DAB (3,3′-diaminobenzidina tetracloridrato idrato)	Sigma-Aldrich	D-5637	cancerogeno, sensibile alla luce
Fluoromount-G	Biotecnologie meridionali	Codice 0100-01
Anticorpi primari
coniglio IgG1 α-Ki67
α-GFAP, AS-3-GF	Novocastra/ Leica Biosystems	NCL-L-Ki67MM1	DAB 1:400/IF 1:100; richiede il recupero dell'epitopo
IgG di capra (H+L) α-GFP	Sistemi Sinaptici	Codice: 173 002	09:20
IgG1 di topo α-nestina	Anticorpi Acris	R1091P	Ore 06:00
porcellino d'india IgG (H+L) α-Doublecortina	Abcam	AB6142	1:200; richiede il recupero dell'epitopo
ratto IgG2a α-BrdU (ascite)	Merck Millipore	AB2253	09:20
ratto IgG2a α-BrdU (purificato)	AbD Serotec/ Bio-Rad	OBT0030CX	per il rilevamento di BrdU; DAB 1:500/IF 1:400
IgG1κ di topo α-BrdU	AbD Serotec/ Bio-Rad	OBT0030	per il rilevamento di CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400
IgG1 per topo α-NeuN	BD Bioscienze	Telefono 347580	per il rilevamento di IdU; DAB 1:500/IF 1:350
Anticorpi secondari	Merck Millipore	Visualizzazione MAB377	09:20
asino α-porcellino d'India IgG (H+L)-Biotina
asino α-ratto IgG (H+L)-Biotina	Dianova	711-065-152	09:20
asino α-topo IgG (H+L)-Biotina	Dianova	712-065-150	09:20
α-ratto per capra IgG (H+L)-Alexa Fluor 488	Dianova	715-065-151	09:20
asino α-capra IgG (H+L)-Alexa Fluor 488	Sonde molecolari	Codice: A11006	05:10
asino α-topo IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment	Sonde molecolari	Codice A11055	05:10
asino α-topo IgG (H+L)-Alexa Fluor 647	Dianova	715-097-003	Ore 02:40
asino α porcellino d'India IgG (H+L)-Alexa Fluor 647	Dianova	715-605-151	05:10
asino α-ratto IgG (H+L)-Rodamina Rosso-X	Dianova	706-605-148	05:10
asino α-coniglio IgG (H+L)-Rodamina Rosso-X	Dianova	712-295-150	05:10
asino α-porcellino d'India IgG (H+L)-Rodamina Rosso-X	Dianova	711-295-152	05:10
Streptavidina-Rodamina Rosso-X	Dianova	706-296-148	05:10
α per capre IgG (H+L)-AMCA	Dianova	Codice 016-290-084	09:20
Hoechst 33342	Dianova	Codice 111-155-144	1:250, funziona solo con coniglio α-GFAP
DAPI	Sonde molecolari	H3570	Ore 17:40
inceppamento	Sonde molecolari	D1306	Ore 17:40
Frammento di favola asino α-topo IgG (H+L)
Favoloso frammento d'asino α-coniglio IgG (H+L)	Dianova	715-007-003	01:20
Siero d'asino normale	Dianova	711-007-003	01:20
Siero di coniglio normale	Merck Millipore	S30
Siero di capra normale	Dianova	011-000-010
Albumina di siero bovino	Dianova	005-000-001
istologia	Sigma-Aldrich	Codice: A7906
Cresyl violet
Neo-Trasparente	Sigma-Aldrich	Codice: C5042
Neo-Mount	Merck Millipore	109843	sostituto non tossico dello xilene
microscopia	Merck Millipore	109016	supporto di montaggio permanente
Assioskop 2
Pannello LSM 710	Microscopia Carl Zeiss
	Microscopia Carl Zeiss