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1. Preparazione degli animali
- Anestetizzare i topi usando isoflurano al 3%. Apri il torace praticando un'incisione orizzontale nella regione sopra l'addome medio e tirando la pelle. Praticare con cura un'altra incisione per aprire la cavità toracica senza perforare altri organi.
- Perfondere il cuore prima attraverso l'apice e poi il ventricolo destro utilizzando glutaraldeide fredda al 3% in soluzione cardioplegica (50 mM KCl, destrosio al 5% in PBS, vedi Tabella 1) per 2 minuti per garantire il completo rilassamento miocardico.
- Perfondere il cuore utilizzando glutaraldeide ghiacciata al 3% in 0,1 M di tampone cacodilato di sodio (pH 7,4) per altri 2 minuti. Usando la pressione di gravità, utilizzare un ago da 25 G 5/8" per introdurre i fissativi nel cuore. Immediatamente dopo che il cuore inizia a riempirsi con il fissativo, sollevare l'apice del cuore e tagliare i vasi sottostanti a 1-2 mm dal cuore per alleviare la pressione e consentire ai liquidi di defluire.
- Sezionare il cuore, rimuovere gli atri e immergere i ventricoli in una capsula di Petri in una capsula di Petri in una capsula di Petri al 3% di glutaraldeide ghiacciata al 3% / 0,1 M di cacodilato. Eseguire un taglio a farfalla dopo 30-60 minuti di fissazione e metterlo in una capsula di Petri contenente il 3% di glutaraldeide/cacodilato (vedi Tabella dei materiali). Tritare il cuore utilizzando una lama chirurgica in piccoli cubetti di 1 mm3 mentre è in soluzione di glutaraldeide/cacodilato.
- Fissare/immergere il tessuto cardiaco sezionato in una soluzione di glutaraldeide/cacodilato per 24 ore a 4 °C.
2. Elaborazione del tessuto cardiaco
- Dopo 24 ore di fissaggio, lavare i fazzoletti in 0,1 M di tampone di cacodilato di sodio per 20 minuti.
- Preparare il tampone di cacodilato 0,1 M seguendo i passaggi seguenti.
- Per preparare un tampone cacodilato di sodio 0,1 M, preparare una scorta di tampone cacodilato di sodio 1 M sciogliendo il cacodilato di sodio (21,4 g) e la soluzione di cloruro di calcio all'1% (3 mL) in 90 mL di acqua distillata. Aumentare la soluzione a 100 ml aggiungendo l'acqua distillata. Mescola bene la soluzione e lasciala sciogliere il soluto per una notte.
- Quindi, prendere 10 mL di soluzione madre di cacodilato di sodio 1 M e aggiungerla a 80 mL di acqua distillata. Regolare il pH a 7,4 utilizzando HCl e aumentarlo fino a 100 ml aggiungendo acqua distillata.
- Ripetere il lavaggio in tampone di cacodilato di sodio 0,1 M per altri 20 minuti. Rimuovere i fazzoletti dal tampone di cacodilato di sodio e immergerli in una soluzione di tetrossido di osmio al 2% per 4 ore a temperatura ambiente. Questo processo è chiamato osmicazione.
- Preparare una soluzione di tetrossido di osmio al 2% seguendo i passaggi seguenti.
- Per preparare una soluzione di tetrossido di osmio al 2%, assumere una soluzione di tetrossido di osmio al 4%, 4 ml (vedere la tabella dei materiali), 1 M di soluzione madre di cacodilato di sodio (0,8 ml) e acqua distillata (3,2 ml) per ottenere un totale di 8 ml di soluzione.
nota: L'intero processo e i passaggi successivi devono essere eseguiti nella cappa aspirante.
- Dopo l'osmicazione, immergere i tessuti in una soluzione di acetato di sodio al 2% per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Preparare una soluzione di acetato di sodio al 2% sciogliendo 4 g di acetato di sodio in 20 ml di acqua distillata.
- Successivamente, immergere i tessuti in una soluzione di acetato di uranile al 2% per 1 ora a temperatura ambiente.
- Preparare una soluzione di acetato di uranile al 2% sciogliendo 4 g di acetato di uranile in 20 ml di acqua distillata.
- Dopo la colorazione con acetato di uranile, disidratare i tessuti in sequenza attraverso gli alcoli graduati e l'acetone nell'ordine indicato nella Tabella 2.
3. Inclusione del tessuto cardiaco
- Incorporare i tessuti disidratati in resina epossidica a bassa viscosità seguendo i passaggi seguenti.
- Per produrre resina epossidica a bassa viscosità, mescolare 10,24 mL di monomero epossidico di vinilcicloesene diossido, 6,74 mL di diglicidil etere di glicole polipropilenico (DER 732) e 30,05 mL di anidride nonenilsuccinica (NSA) (vedere la Tabella dei materiali) in una provetta da 50 mL. Mescolare bene la sospensione a mano per 2 minuti.
- Aggiungere 18 gocce di acceleratore epossidico 2-dimetilamminoetanolo (DMAE, vedere la Tabella dei materiali) e mescolare la sospensione per miscelare accuratamente i componenti.
- Impregnare i tessuti in resina epossidica nella successiva sequenza di miscela.
- Sostituire la sospensione di acetone 100% con resina 1:1: acetone e immergere i tessuti per 1 ora a temperatura ambiente.
- Sostituire la resina 1:1: sospensione di acetone con la resina 6:1: sospensione di acetone e immergervi i tessuti per 3 ore.
- Infine, sostituisci la resina 6:1: sospensione di acetone con una sospensione di resina al 100% e lascia i tessuti immersi in essa per una notte a temperatura ambiente.
- Mettere i tessuti in resina fresca in micro stampi da 8 mm (vedi Tabella dei materiali) e polimerizzare i tessuti incorporati a 70 °C durante la notte.
nota: Assicurarsi che la resina sia dura ma non fragile dopo l'indurimento.
4. Sezionamento tissutale con ultramicrotomo
- Tagliare i blocchi di resina con il tessuto a non più grandi di 1 mm prima di montarli sull'ultramicrotomo (vedi Tabella dei materiali). Posizionare lo stampo nel modo più preciso possibile nel braccio segmentato dell'ultramicrotomo e far avanzare manualmente lo stampo del campione verso il coltello diamantato.
- Tagliare le sezioni a uno spessore di 500 nm (mezzo micron) con un coltello Histo (vedi Tabella dei materiali) e, utilizzando lo strumento EM loop, raccoglierle e posizionarle su un vetrino.
- Posizionare il vetrino su una piastra calda per la colorazione blu di toluidina per trovare l'area di interesse.
- Dopo aver trovato l'area di interesse, utilizzare un coltello Ultra 45° (vedi Tabella dei materiali) per produrre sezioni ultrasottili in oro pallido (100 nm). Posiziona queste sezioni ultrasottili sul lato opaco di una griglia di rame da 200 mesh.
5. Colorazione ultrasottile della sezione cardiaca
- Iniziare la colorazione smascherando l'antigene utilizzando una soluzione mordenzante, cioè una soluzione meta-periodato di sodio al 5%.
- Preparare 500 μL di soluzione di metaperiodato di sodio al 5% (vedi Tabella dei materiali) in acqua distillata.
nota: Preparare una soluzione fresca prima dell'uso.
- Mettere 20 μL di soluzione di metaperiodato di sodio su un film di paraffina pulito. Posizionare le griglie completamente asciutte con sezioni di tessuto sulla gocciolina della soluzione di mordenzatura.
nota: Il lato opaco della griglia con la sezione di tessuto deve essere rivolto verso la soluzione di mordenzatura.
- Lasciare la griglia di sezione sulla soluzione per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Lavare la sezione di tessuto mordenzata posizionandola su una goccia di acqua distillata per 60 s.
- Bloccare le aldeidi residue posizionando le griglie di sezione su una goccia di soluzione di glicina 0,05 M per 10 min a temperatura ambiente. Tamponare i bordi della griglia su carta da filtro per rimuovere la soluzione di glicina residua.
- Preparare una soluzione di glicina 0,05 M (vedere la Tabella dei materiali) sciogliendo 3,75 mg di glicina in 1 mL di 1x PBS (pH 7,4).
- Porre le griglie di sezione in 10-20 μL di soluzione bloccante per 25 minuti a temperatura ambiente.
nota: Composizione della soluzione bloccante: 2 μL di siero di capra normale all'1% (NGS) + 20 μL di BSA all'1% (concentrazione finale: 10%) + 178 μL di 1x PBS (pH 7,4) per ottenere un volume finale di 200 μL.
- Tamponare i bordi della griglia su carta da filtro e posizionare la sezione della griglia sul diluente anticorpale per il condizionamento a temperatura ambiente per 10 minuti.
- Incubare le sezioni della griglia con l'anticorpo primario (Sigmar1 in questo caso, vedere la Tabella dei materiali; diluito 1:10 in diluente per anticorpi) per 1 ora e 30 minuti in una camera umidificata.
- Asciugare la griglia e lavare le sezioni della griglia con diluente anticorpale due volte per 5 minuti ciascuna.
- Incubare le sezioni della griglia con anticorpo secondario biotinilato (in questo caso, anticorpo secondario policlonale biotinilato di capra anti-coniglio, vedere Tabella dei materiali; diluito 1:10 in diluente anticorpale) per 1 ora in una camera umidificata.
- Asciugare la griglia e lavare le sezioni della griglia con diluente anticorpale due volte per 5 minuti ciascuna.
- Incubare le sezioni della griglia in QD coniugato con streptavidina disponibile in commercio (QD655nm, vedi Tabella dei materiali; diluito 1:10 in diluente anticorpale) per 1 ora in una camera umidificata a temperatura ambiente. Prevenire l'esposizione alla luce coprendo la camera con un foglio di alluminio.
- Asciugare i bordi della griglia con carta da filtro e lavare le sezioni della griglia posizionandole su gocce d'acqua per 2 minuti.
- Tamponare i bordi della griglia per farli asciugare.
Tabella 1: Composizione del PBS e di altre soluzioni utilizzate per la disidratazione dei tessuti.
| buffer | composizione | quantità |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (1x) (1 L) | cloruro di sodio | 8 g |
| cloruro di potassio | 0,2 g |
| Fosfato di sodio bibasico | 1,44 g |
| Fosfato di potassio monobasico | 0,24 g |
| Regolare il pH a 7,4 | |
Tabella 2: Applicazione di alcol e acetone graduati per la disidratazione dei tessuti (Passaggio 2.5)
| componente | Ore |
| 50% etanolo | 10 minuti |
| 70% etanolo | 10 minuti |
| 95% etanolo | 10 minuti |
| 100% etanolo | 20 minuti |
| 100% etanolo | 20 minuti |
| 100% acetone | 30 minuti |
| 100% acetone | 30 minuti |