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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione animale e fissazione dei reni
- Eseguire la fissazione della perfusione seguendo i passaggi seguenti.
- Anestetizzare il topo mediante inalazione di isoflurano (3%, 2,0 L/min) e somministrazione intraperitoneale di medetomidina cloridrato (0,3 mg/kg), butorfanolo tartrato (5 mg/kg) e midazolam (4 mg/kg) (vedere la Tabella dei materiali).
- Perfondere l'animale con 20 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, pH 7,4) e 30 mL di paraformaldeide (PFA) al 4% in tampone fosfato (PB) attraverso il ventricolo sinistro del cuore.
- Eseguire la fissazione per immersione subito dopo la fissazione per perfusione e il prelievo renale.
- Immergere il rene in PFA al 4% a 4 °C per altre 16 ore, quindi lavarlo con PBS per 2 ore (tre volte)9 (Figura 1).
cautela: La formaldeide e la paraformaldeide sono irritanti tossici. Maneggiare i reagenti in una cappa aspirante con adeguati dispositivi di protezione individuale.
2. Decolorazione e delipidazione
- Preparare CUBIC-L (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis) per la decolorazione e la delipidazione costituiti dal 10% in peso di Triton X-100 e dal 10% in peso di N-butildietanolammina (vedere Tabella dei materiali), seguendo i rapporti precedentemente pubblicati.
- Eseguire la decolorazione e la delipidazione con CUBIC-L seguendo i passaggi seguenti.
- Immergere il rene fisso in 7 mL di CUBIC-L al 50% (v/v) (miscela 1:1 di acqua e CUBIC-L) in una provetta a fondo tondo da 14 mL (vedere la Tabella dei materiali) agitando delicatamente a temperatura ambiente per 6 ore (Figura 2A). Quindi, immergerlo in 7 mL di CUBIC-L in una provetta a fondo tondo da 14 mL agitando delicatamente a 37 °C per 5 giorni.
- Aggiornare CUBIC-L ogni giorno durante questo processo. Dopo il processo di decolorazione e delipidazione, lavare il rene con PBS a temperatura ambiente per 2 ore (tre volte) (Figura 1). Utilizzare un cucchiaio di erogazione per la manipolazione del campione (Figura 2B).
3. Colorazione immunofluorescente a montaggio intero
- Preparare i tamponi di colorazione.
- Preparare il tampone di colorazione per gli anticorpi primari mescolando Triton X-100 allo 0,5% (v/v), caseina allo 0,5% in PBS e sodio azide allo 0,05%.
- Preparare il tampone di colorazione per gli anticorpi secondari mescolando Triton X-100 allo 0,5% (v/v), caseina allo 0,1% in PBS e sodio azide allo 0,05%.
- Eseguire la colorazione con anticorpi primari.
- Immunocolorare il rene delipidato con anticorpi primari (1:100 o 1:200, vedi Tabella dei materiali) nel tampone di colorazione a 37 °C con agitazione delicata per 7 giorni.
nota: La quantità di tampone di colorazione necessaria per un rene è di 500-600 μl (Figura 2C).
- Lavare il rene con Triton X-100 allo 0,5% (v/v) in PBS (PBST) a temperatura ambiente per 1 giorno (Figura 1).
- Eseguire la colorazione con anticorpi secondari.
- Immunocolorare il rene con anticorpi secondari (1:100 o 1:200, vedi Tabella dei materiali) nel tampone di colorazione a 37 °C agitando delicatamente per 7 giorni. Lavare il rene con PBST a temperatura ambiente per 1 giorno (Figura 1).
- Dopo la fissazione, immergere il rene in formaldeide all'1% in PB (miscela 1:36 di formaldeide al 37% e PB) per 3 ore e lavarlo con PBS a temperatura ambiente per 6 ore (Figura 1).
4. Corrispondenza dell'indice di rifrazione (RI)
- Preparare CUBIC-R+.
- Preparare CUBIC-R mescolando il 45% in peso di 2,3-dimetil-1-fenil-5-pirazolone/antipirina e il 30% in peso di nicotinamide (cfr. tabella dei materiali).
- Preparare CUBIC-R+ per la corrispondenza dell'indice di rifrazione (RI) aggiungendo lo 0,5% di N-butildietanolammina a CUBIC-R seguendo i rapporti precedentemente pubblicati.
- Eseguire la corrispondenza RI.
- Immergere il rene in 7 mL di CUBIC-R+ al 50% (v/v) (miscela 1:1 di acqua e CUBIC-R+) in una provetta a fondo tondo da 14 mL agitando delicatamente a temperatura ambiente per 1 giorno. Quindi, immergerlo in 7 mL di CUBIC-R+ in una provetta a fondo tondo da 14 mL agitando delicatamente a temperatura ambiente per 2 giorni (Figura 1).
nota: Sebbene il rene galleggi al 50% in CUBIC-R+ all'inizio della corrispondenza dell'RI, affonda e diventa trasparente in CUBIC-R+ alla fine del processo (Figura 2D).
5. Acquisizione e ricostruzione delle immagini
- Immergere il rene con corrispondenza RI in una miscela di olio siliconico (RI = 1,555) e olio minerale (RI = 1,467) (55:45) durante l'acquisizione dell'immagine (RI = 1,51) (Figura 3).
- Acquisisci immagini 3D dell'intero rene con un microscopio fluorescente a foglio luminoso personalizzato (vedi Tabella dei materiali). Raccogli tutti i dati delle immagini grezze in un formato TIFF a 16 bit. Visualizza e cattura le immagini renderizzate in 3D con il software di analisi delle immagini (Imaris, vedi Tabella dei materiali).
