Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto,
1. Raccolta di biopsia cutanea
- Lasciare che un medico qualificato esegua la biopsia cutanea in un contesto clinico appropriato.
- Scegli l'area in cui eseguire la biopsia cutanea e puliscila con un tampone imbevuto di alcol.
- Preparare la soluzione anestetica con 1 cc di lidocaina al 2%.
- Con l'ago parallelo all'area, iniettare l'anestesia locale per via sottocutanea.
- Dopo aver verificato l'effetto dell'anestesia, prendere il punzone monouso da 3 mm e applicare una pressione rotazionale e delicata verso il basso per farlo ruotare verso il basso attraverso l'epidermide e il derma, fino a raggiungere il grasso sottocutaneo.
- Ritira il pugno.
- Utilizzare una pinza usa e getta per sollevare delicatamente il tappo cutaneo.
- Usa le forbici per ritagliare la base del campione a livello del tessuto adiposo.
- Collocare il campione in una provetta contenente 10 mL di soluzione fissativa di periodato-lisina-paraformaldeide (PLP).
- Disinfettare l'area e coprirla con una benda adesiva.
2. Fissazione e conservazione dei tessuti
- Preparare una nuova soluzione fissativa PLP (vedere Tabella 1).
- Immediatamente dopo il prelievo della biopsia cutanea, immergerla in una provetta contenente 10 mL di soluzione fissativa PLP e incubarla per una notte (O/N) a 4 °C.
- Il giorno dopo, sotto la cappa aspirante, rimuovere delicatamente il fissativo PLP e nella stessa provetta, lavare la biopsia 3 volte per 5 minuti con 5 mL di soluzione di Sorensen 0,1 M (Tabella 1).
- Scartare la soluzione di Sorensen e incubare la biopsia con 5 mL di soluzione crioprotettiva O/N a 4 °C.
- Conservare la biopsia a 4 °C se il taglio con un criotomo viene eseguito entro 1 settimana; conservare la biopsia a -20 °C se il taglio viene eseguito entro 3 mesi; incorporare la biopsia in un criomold (fasi 3.2-3.4) e conservarla a -80 °C per conservarla per un periodo di tempo più lungo.
3. Taglio del tessuto con un criotomo
- Impostare il criotomo a -20 °C.
- Prendi un criopoldo e riempilo con il mezzo di crioincorporamento. Evita di creare bolle.
- Utilizzando una pinzetta, immergere la biopsia nel mezzo di crioinclusione con l'asse longitudinale (epidermide - derma) parallelo al fondo del criostampo.
- Congelare a scatto il campione con azoto liquido per ottenere un cubo solido di terreno crio-incorporante contenente la biopsia con il giusto orientamento.
- Mettere il campione nel criostato e attendere 30 minuti per consentire alla biopsia di acclimatarsi.
- Fissare il campione sul criostato e tagliare sezioni da 50 μm.
- Con l'aiuto di un pennellino, trasferire le criosezioni in una piastra a 96 pozzetti contenente 200 μL di soluzione antigelo in ogni pozzetto. Una sezione per pozzetto.
- Conservare a -20 °C.
nota: Se l'analisi non viene analizzata l'intera biopsia, tagliarla solo parzialmente. In questo caso, le sezioni devono essere conservate a -20 °C e la parte rimanente della biopsia a -80 °C per conservarla per un periodo di tempo più lungo.
4. Colorazione in immunofluorescenza
- Riempire una piastra da 96 pozzetti con 100 μL di soluzione di lavaggio.
- Trasferire le sezioni da analizzare dalla piastra di conservazione a quella nuova contenente la soluzione di lavaggio. 1 sezione per ogni pozzetto (4 sezioni per sito anatomico, per paziente: di solito un totale di 12 sezioni per paziente).
- Lasciare la ciocca nella soluzione di lavaggio per 10 minuti a temperatura ambiente (RT). Trasferire la sezione in un altro pozzetto contenente la stessa soluzione e ripetere il lavaggio.
- Spostare le sezioni in nuovi pozzetti contenenti 100 μL di soluzione bloccante e incubare per almeno 90 minuti e per un massimo di 4 ore a RT.
- Diluire gli anticorpi primari anti-PGP9.5 (policlonale di coniglio, 1:1000) e anti-5G4 (monoclonale di topo, 1:400) nella soluzione di lavoro.
- Trasferire le sezioni in nuovi pozzetti contenenti 100 μl della soluzione di lavoro degli anticorpi primari e incubarle O/N a RT.
- Come passaggio 4.3, lavare le sezioni 2 volte per almeno 10 minuti a RT, con 100 μL di soluzione di lavaggio.
- Diluire gli anticorpi secondari (coniugati con diversi fluorofori), Goat anti-Rabbit per rilevare PGP9.5 (1:700) e Goat Anti-Mouse per rilevare 5G4 (1:700) nella soluzione di lavoro.
- Trasferire le sezioni in nuovi pozzetti contenenti 100 μl della soluzione di lavoro degli anticorpi secondari per 90 minuti a RT. Da questo punto, coprire la piastra a 96 pozzetti con un foglio di alluminio per evitare lo sbiancamento del fluoroforo coniugato con gli anticorpi secondari.
- Come passaggio 4.3, lavare le sezioni 2 volte per almeno 10 minuti, con 100 μL di soluzione di lavaggio.
- Trasferire le sezioni in nuovi pozzetti contenenti 100 μl di 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI, diluito 1:5.000 in soluzione salina tamponata con fosfato [PBS] 1x) per 5 minuti a RT.
- Come passaggio 4.3, lavare le sezioni 2 volte per almeno 10 minuti, con 100 μL di soluzione di lavaggio.
- Montare le sezioni su una guida nella posizione corretta evitando di ripiegarle erroneamente.
- Aggiungere alcune gocce del mezzo di montaggio sul vetrino e coprire con un vetrino coprioggetti.
- Lasciare asciugare i vetrini O/N prima di utilizzare il microscopio confocale/a fluorescenza.
- Conservare i vetrini in un'apposita scatola a 4 °C evitando l'esposizione alla luce. Se memorizzato accuratamente, il segnale sarà visibile per circa 6 mesi.
nota: Il trasferimento di una sezione dalla piastra a 96 pozzetti contenente le fette appena tagliate alla piastra a 96 pozzetti contenente la soluzione di lavaggio (fase 4.1) viene eseguito utilizzando un piccolo spazzolino che aiuta a prelevare la biopsia. Dopo il trasferimento della sezione nel primo pozzetto, ogni volta che la fetta deve essere incubata con una soluzione diversa, spostarla da un pozzetto all'altro con l'aiuto del pennello.
5. Imaging in immunofluorescenza
- Visualizzate le sezioni con un microscopio a fluorescenza invertito o un microscopio confocale (ingrandimento 20X, 40x o superiore, utilizzare fotogrammi successivi con incrementi di 2 μm su un piano Z-stack per ottenere i migliori risultati).
- Acquisizione di immagini da una fotocamera collegata al microscopio
- Utilizzare un software di imaging adeguato (ad esempio ImageJ) per analizzare i segnali positivi in sezioni in termini di distribuzione spaziale e intensità del segnale. A tale scopo, eseguire i passaggi indicati di seguito.
- Aprire il file con il software ImageJ.
- Fare clic su Immagine > colore > dividere i canali per analizzare ciascun canale di colore.
- Fare clic su Immagine > impilare > progetto Z per ottenere un'unione di più acquisizioni di sezioni.
- Fare clic su Immagine > colore > unire i canali per ottenere un'unione di diversi canali di colore della stessa acquisizione.
Tabella 1: Soluzioni richieste. Elenco delle soluzioni richieste per il protocollo e breve descrizione di come prepararlo.
Soluzione antigelo
(conservare a 4 °C per un massimo di 6 mesi) | 30% Glicerolo
30% Glicole etilenico
30% dH2O
10% 2x Tampone fosfato |
Soluzione bloccante
(prepararsi al momento) | 4% Siero di capra normale
1% Triton X-100
in Soluzione di lavaggio |
Crioprotettore
(conservare a 4 °C per un massimo di 6 mesi) | 20% Glicerolo
80% della soluzione di Sorensen |
Soluzione di idrogeno fosfato disodico
(conservare presso RT fino a 6 mesi) | 0,45 M di idrogeno fosfato disodico (Na2HPO4) in dH2O
Filtrare in un flacone sterile |
Soluzione di lisina
(conservare a 4 °C per un massimo di 3 settimane) | 50% di soluzione di monocloridrato di L-lisina 0,3M
50% della soluzione di Sorensen 0,1M pH 7,6
pH 7,4, filtrare in flacone sterile |
Paraformaldeide (PFA) 8%
(preparare sotto cappa aspirante e conservare a 4 °C per un massimo di 1 mese) | 2,6 M PFA in dH2O (fino a 55°C_do non superare i 60 °C per evitare la formazione di acido formico)
Filtro in flacone sterile |
Tampone fosfato 2x
(conservare a 4 °C per un massimo di 6 mesi) | Soluzione di fosfato monosodico al 6% (NaH2PO4
Soluzione di fosfato disodico al 45% (Na2HPO4) in dH2O |
Soluzione fissativa PLP
(preparare al momento, sotto cappa aspirante) | 25% Paraformaldeide 8%
0,01 M di sodio (meta)periodato
Soluzione di lisina al 75% |
Sodio Diidrogeno Fosfato Monoidrato
(conservare presso RT fino a 6 mesi) | 0,52 M di sodio diidrogeno fosfato monoidrato (NaH2PO4*H2O) in dH2O
Filtrare in un flacone sterile. |
La soluzione di Sorensen
(conservare a 4 °C per un massimo di 1 mese) | Soluzione di fosfato monosodico al 2,5%
Soluzione di fosfato disodico al 18,7%
pH 7,6, in dH2O |
Soluzione di lavaggio
(prepararsi al momento) | 0,25 M Trizma base
0,26 milioni di NaCl
pH 7,6, in dH2O |
Soluzione funzionante
(prepararsi al momento) | Soluzione bloccante al 50%
50% Soluzione di lavaggio |
