Utilizzo della tomografia mediata dalla fluorescenza per valutare l'infiammazione intestinale murina

Abstract

Fonte: Nowacki, T. M., et al. Tomografia mediata dalla fluorescenza per il rilevamento e la quantificazione dell'infiammazione intestinale murina correlata ai macrofagi. (2017)

Questo video mostra una tecnica per valutare l'infiltrazione intestinale dei macrofagi in un modello murino di colite utilizzando la tomografia mediata dalla fluorescenza (FMT). Dopo aver indotto la colite in un topo tramite destrano solfato di sodio (DSS), all'animale vengono iniettati anticorpi che riconoscono il marcatore glicoproteico F4/80 sui macrofagi infiltrati nel colon. Il topo viene quindi riprodotto in un dispositivo FMT in cui i segnali di fluorescenza e riflettanza vengono ricostruiti in un'immagine tridimensionale per determinare la distribuzione spaziale e l'intensità della fluorescenza.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Materiali e configurazione sperimentale

1. Cura degli animali.
   1. Utilizzare topi di qualsiasi ceppo sensibile al DSS (ad es. C57BL/6) con un peso corporeo di 20-25 g.
   2. Pianifica almeno cinque o più topi per gruppo sperimentale e ospita i topi secondo le linee guida locali per la cura degli animali.
   3. Fornire una dieta standard per roditori e acqua potabile autoclavata ad libitum.
   4. Rimuovere il chow standard e sostituirlo con chow senza erba medica almeno tre giorni prima della scansione per ridurre l'autofluorescenza endoluminale.
2. Induzione della colite acuta indotta da DSS.
   1. Sciogliere 2 g di DSS (peso molecolare ~40.000 Da) in 100 mL di acqua potabile autoclavata per ottenere una soluzione al 2% (p/v).
   2. Riempire la scorta di acqua potabile dei topi esclusivamente con la soluzione DSS e stimare 5 ml di liquido per topo al giorno. Fornire la stessa acqua potabile senza DSS ai topi di controllo.
      nota: Monitora i topi ogni giorno fino alla fine dell'esperimento. Eutanasia i topi che perdono più del 20% del loro peso corporeo iniziale o che diventano moribondi (ad esempio, postura persistentemente curva, diminuzione del movimento, respirazione affannosa, pelo marcatamente eretto) secondo le linee guida locali applicabili sul benessere degli animali.
3. Preparazione della tomografia mediata da fluorescenza.
   1. Etichettare l'anticorpo desiderato (ad es. rat anti-mouse F4/80) con un colorante a fluorescenza (ad es. Cianina7,_eccitazione λ: 750 nm,_emissione λ: 776 nm) come descritto nel protocollo del produttore. Dializzare l'anticorpo purificato in una membrana di dialisi appropriata (dimensione dei pori < 50-100 kDa) contro 1 L di cloruro di sodio 0,15 M per almeno 2 ore o durante la notte.
      1. Trasferire l'anticorpo a 1 L di 0,1 M NaHCO₃ e dializzare per almeno 2 ore.
      2. Sciogliere la quantità necessaria di colorante fluorescente in dimetilsolfossido (DMSO) (10,8 μL/mg di anticorpo) e aggiungerla alla soluzione anticorpale. Utilizzare il colorante fluorescente in eccesso molare di 20 volte per ottenere un rapporto colorante/proteina di 1:3.
      3. Incubare al buio a 4 °C per 1 ora. Rimuovere gli anticorpi non marcati mediante dialisi contro 1 L di sodio 0,15 M o utilizzando una colonna di desalinizzazione PD-10 e risolverli in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per l'applicazione in vivo.
      4. Determinare la concentrazione finale di anticorpi e il rapporto di marcatura mediante spettrofotometria.
      5. Misurare la concentrazione proteica con un assorbimento di 250-330 nm e considerare un assorbimento aggiuntivo da parte del colorante. Correggere l'assorbimento massimo a 280 nm (proteina) dell'11% dell'assorbimento massimo a 750 nm (passaggio successivo) per la marcatura della cianina.
      6. Misurare una diluizione del composto (tipicamente 1:10) a 250-800 nm ed estrarre la concentrazione di cianine7 a 750 nm.
      7. Determinare il rapporto colorante/proteina come: colorante/anticorpo = assorbimento massimo a 750 nm / 200.000 / (assorbimento massimo a 280 nm - 0,11 x assorbimento massimo a 750 nm) / 170.000.
      8. Mantenere la soluzione di anticorpi a 4 °C e proteggerla dalla luce per evitare lo sbiancamento prima dell'iniezione.
   2. Caricare il volume necessario di soluzione anticorpale in una siringa sterile immediatamente prima dell'iniezione e proteggerla dalla luce fino al momento dell'uso.
   3. Determinare il momento ottimale dell'iniezione della sonda e la procedura di scansione, in base alla farmacocinetica del tracciante.
   4. Anestetizzare i topi utilizzando l'1,5-2,5% di isoflurano inalato in ossigeno o posizionarli in modo sicuro in un sistema di contenzione dedicato per l'iniezione degli anticorpi marcati nella vena caudale.
   5. Per gli anticorpi a lunghezza intera, iniettare l'anticorpo marcato almeno 24 ore prima della scansione, ad esempio per la visualizzazione dei macrofagi F4/80 anti-topo nella colite murina. Iniettare i topi per via endovenosa (e.v.) attraverso la vena caudale con anticorpi marcati in una quantità corrispondente a 2,0 nmol di colorante.
   6. Utilizzare anticorpi non specifici ugualmente marcati (ad esempio, IgG di ratto o un altro isotipo corrispondente al patrimonio anticorpale primario) come controllo dell'isotipo in dosi equivalenti a quelle della sonda specifica.
      nota: I risultati delle scansioni in vivo dopo l'iniezione del composto di controllo possono servire come riferimento per l'interpretazione dei dati specifici di imaging della sonda.
   7. Usa un rasoio elettrico per radere il pelo dell'animale nella regione addominale per ridurre al minimo la riflessione e l'assorbimento della luce.

2. Attrezzatura tecnica

1. Utilizzare un dispositivo veterinario per la tomografia mediata da fluorescenza (FMT) per la fluorescenza di piccoli animali (Figura 1).
2. Crea un nuovo studio per ogni progetto facendo clic sul pulsante "nuovo studio" e includi nella descrizione dello studio i traccianti pertinenti, inclusi i parametri di imaging e le dosi per riferimento futuro.
3. All'interno di questo studio, creare gruppi di studio in base al rispettivo disegno di studio (ad esempio, per il tracciante specifico e il controllo dell'isotipo non specifico) facendo clic sul pulsante "nuovo gruppo di studio". Equipaggia ogni gruppo di studio con il rispettivo numero di animali.
4. Calibrare il sistema per i costrutti traccianti.
   1. Eseguire la calibrazione per ogni lotto di traccianti per normalizzare la variazione nell'etichettatura e abilitare la misurazione quantitativa dai dati OI.
   2. Seguire le indicazioni del produttore dello strumento per la calibrazione di ogni singolo sistema; dopo aver selezionato "aggiungi nuovo tracciante", il sistema fornirà una guida attraverso i passaggi. Fornire la diluizione della soluzione anticorpale applicata e la concentrazione assoluta calcolata del tracciante nella sonda.
   3. Per l'FMT, utilizzare un fantoccio che imita i tessuti di spessore e caratteristiche di assorbimento definite (simile al tessuto vitale) e riempirlo con un volume specifico della soluzione anticorpale utilizzata. Misuralo sul dispositivo FMT.
      nota: Il sistema utilizzerà la misura di riferimento della sonda fornita, insieme alla concentrazione data, per calcolare le concentrazioni assolute del tracciante da future misurazioni in vivo.
5. Utilizzare una cassetta da visita riscaldabile con una temperatura di 42 °C.
   nota: Ciò impedisce ai topi di diventare ipotermici durante l'esame.

3. Anestesia animale

1. Utilizzare un flusso continuo di isoflurano all'1,5 - 2% vol% ([2-cloro-2-(difluorometossi)-1,1,1-trifluoro-etano]) e 1,5 L O₂/min per anestetizzare i topi. Utilizzare sistemi di inalazione appositamente progettati per l'anestesia dei roditori (vaporizzatore di isoflurano) per controllare facilmente la profondità dell'anestetico e ridurre al minimo l'esposizione del personale.
2. Posizionare il mouse nella camera di induzione a tenuta stagna e accendere il vaporizzatore per l'erogazione di isoflurano (100% (v/v), 5% vol% in ossigeno, 3 L/min). Monitorare il mouse fino a quando non è sdraiato e incosciente.
3. Posizionarlo nella cassetta dell'esame per la tomografia, con inalazione continua di isoflurano attraverso il cono nasale alla dose di 100% v/v, 1,5 vol% in ossigeno, 1,5 L/min per ridurre al minimo gli artefatti di movimento durante l'esame. Per le procedure che durano più di 5 minuti, applicare un unguento sugli occhi del topo per prevenire danni alla cornea.
4. Valutare la profondità dell'anestesia controllando i riflessi. Appoggia il mouse sul dorso; Se l'anestesia è sufficiente, il topo non deve girarsi. Pizzica delicatamente il mouse tra le dita dei piedi; Se l'anestesia è sufficiente, la gamba non verrà ritirata (stadio di tolleranza chirurgica).

4. Tomografia mediata da fluorescenza

NOTA: Adattare i seguenti dettagli, che sono specifici per il sistema FMT utilizzato in questo studio (vedere la Tabella dei materiali) per dispositivi di imaging alternativi a riflettanza a fluorescenza o sistemi FMT, se necessario.

1. Posizionare il topo anestetizzato sulla schiena nella cassetta dell'esame.
2. Eseguire la procedura di scansione.
   1. Inserire la cassetta nel sistema di imaging e chiuderla immediatamente per garantire un'anestesia continua. Selezionare il campione appropriato dal gruppo di studio creato in precedenza. Selezionare il tracciante somministrato dal menu a discesa per assicurarsi che i valori della concentrazione del tracciante siano calcolati correttamente.
   2. Acquisire l'immagine di riflettanza della fluorescenza alla lunghezza d'onda appropriata (720 nm per Cianina7) per la pianificazione della scansione e delineare il campo di scansione facendo clic sul pulsante "acquisisci immagine".
   3. Verificare che il campo di scansione appaia in sovrapposizione all'immagine di riflettanza della fluorescenza. Adattalo alla regione di interesse (ad esempio, colon o addome), evitando l'aria o le aree di pelo rimanente. A seconda della destinazione dell'immagine, impostare il numero di punti dati dell'immagine all'interno del campo di scansione scegliendo tra la risoluzione del campo di scansione grossolana a media e fine nel menu a destra.
      nota: Tenere presente che un campo di scansione fine potrebbe offrire una migliore risoluzione spaziale al costo di un tempo di scansione significativamente più lungo.
   4. Avviare l'acquisizione di dati/immagini alla lunghezza d'onda selezionata facendo clic su "scansione"
      nota: Il tempo di scansione per una scansione medio-fine di tutto l'addome sarà di circa 5 minuti; In questo periodo, ogni punto dati viene illuminato separatamente dal laser di eccitazione e viene registrata la fluorescenza risultante.
   5. Al termine della scansione, rimuovere l'animale dalla cassetta di imaging e lasciare che l'animale si riprenda completamente prima di rimetterlo nella gabbia.
   6. Ripetere l'FMT se ritenuto necessario in vari momenti durante l'esperimento (ad esempio, giorni 0, 5 e 9 - 10 (fine dell'esperimento)), ma considerare l'accumulo di anticorpi nel corpo, aumentando quindi il segnale di fluorescenza di fondo.

5. Ricostruzione e interpretazione dei dati

1. Utilizzare lo strumento di ricostruzione del rispettivo software di imaging per creare mappe 3D della distribuzione della fluorescenza dai dati di imaging grezzi; le scansioni vengono aggiunte automaticamente allo strumento di ricostruzione quando, al momento della scansione, viene selezionata la funzione "aggiungi alla coda di ricostruzione".
   1. In caso contrario, selezionare le scansioni dal menu a discesa sotto il rispettivo studio e gruppo di studio, fare clic con il pulsante destro del mouse sulla scansione e selezionare "aggiungi alla ricostruzione".
2. Per ulteriori analisi, caricare un set di dati nel software di analisi. Dal menu a tendina nella barra in alto, seleziona il rispettivo studio e poi seleziona il gruppo di studio e il singolo animale dal menu a destra; Verranno mostrate tutte le scansioni eseguite per questo animale. Seleziona la scansione corretta e fai clic su "carica".
   nota: La ricostruzione 3D della distribuzione del tracciante apparirà a sinistra come una sovrapposizione dell'immagine di riflettanza della fluorescenza inizialmente acquisita. Il modello può essere ruotato e ingrandito per facilitare l'analisi.
3. Identificare i focolai di accumulo di etichette aspecifiche (ad esempio, fegato o vescica urinaria) su mappe 3D ricostruite e differenziare dai tessuti bersaglio (ad esempio, intestino o intestino).
4. Dalla barra in alto, seleziona la forma ROI più appropriata per il target. Etichettare il tessuto target come regioni di interesse (ROI) inserendo i rispettivi strumenti di misurazione nel software di analisi; il software fornirà un'intensità di fluorescenza per il ROI, nonché quantità (pico-)molari del tracciante per cui la scansione è stata calibrata.
5. Selezionare la quantità totale di tracciante nell'appropriato ROI, normalizzata per la dimensione del ROI, come l'equivalente più adatto per la valutazione dell'attività di malattia in correlazione con l'infiltrato infiammatorio (istologia).
   nota: Altre caratteristiche del ROI possono essere scelte, se del caso, come rappresentative del particolare modello.

Risultati

Figura 1. Visualizzazione tomografica di infiltrati di macrofagi nella colite murina.

Le scansioni FMT nei topi colitici e i controlli non colitici hanno somministrato anticorpo coniugato Cianina7 contro F4/80 murino (n = 5 per gruppo). (A) Grafico a barre: l'intensità totale della fluorescenza nel pmol del colorante è stata determinata nel ROI...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Reagenti
Dieta priva di erba medica	Harlan Laboritories, Madison, Stati Uniti	2014
Unguento per gli occhi Bepanthen	Bayer, Leverkusen, Germania	80469764
Destrano solfato di sodio (DSS)	Consolato TdB, Uppsala, Svezia	DB001
eosina	Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germania	E 4382
Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)	Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germania	E 9884
Florene 100V/V	Abbott, Wiesbaden, Germania	B506
Ematossilina	Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germania	HHS32-1L
Compound O.C.T. Tissue Tek	Sakura, Zoeterwonde, Paesi Bassi	4583	fissativo per analisi istologiche
Soluzione salina tamponata con fosfato, PBS	Lonza, Verviers, Belgio	Codice: 4629
Cloruro di sodio 0,9%	Braun, Melsungen, Germania	12211095/05/0411
Bicarbonato di sodio in polvere	Sigma Aldrich Deisenhofen, Germania	Episodio 5761
Dieta standard	Altromin, Lage, Germania	Anno 1320
Tissue-Tek Cryomold	Sakura, Leida, Paesi Bassi	4566
Hemoccult (test su carta di guaiaco)	Beckmann Coulter, Germania	3060
Biotina ratto-anti-topo anti-F4/80 anticorpo	Serotec, Oxford, Regno Unito	MCA497B
Biotina ratto-anti-topo anti-GR-1	BD Pharmingen, Heidelberg Germania	553125
Streptavidina-Alexa546	Sonde molecolari, Darmstadt, Germania	S-11225	Eccitazione/emissione massima: 556/573 nm
Anticorpo anti-CD11b ratto-anti-topo TC	Calteg, Burlingame, Stati Uniti	R2b06
Anticorpo purificato anti-topo F4/80	BioLegend, Londra, Regno Unito	123102
DAPI	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germania	D9542
Anticorpo anti-ratto-anti-topo coniugato con FITC	BD Pharmingen, Heidelberg, Germania	553104
Tampone FACS	BD Pharmingen, Heidelberg, Germania	342003
Cy7 NHS Estere	GE Healthcare Europe, Friburgo, Germania	PA17104
MPO ELISA	Immundiagnostik AG, Bensheim, Germania	K 6631B
Anticorpo F4/80 anti-topo marcato Cy5.5	BioLegend, Londra, Regno Unito	123127	anticorpi marcati pronti all'uso (alternativa)
Antigene F4/80 anti-topo PerCP-Cianina5.5	eBioscience, Waltham, Stati Uniti	45-4801-80	anticorpi marcati pronti all'uso (alternativa)
DMSO (dimetilsolfossido)	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germania	67-68-5
Isoflurano	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germania	792632
etanolo	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germania	64-17-5
Albumine sieriche bovine (BSA)	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germania	Codice: A4612
Soluzione salina tamponata Tris (TBS)	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germania	SRE0032
attrezzatura
Sistema di citometria a flusso FACS Calibur	BD Biosciences GmbH, Heidelberg, Germania
Sistema di imaging in vivo FMT 2000	PerkinElmer Inc., Waltham, MA, Stati Uniti	FMT2000
Software di analisi delle immagini True Quant 3.1	PerkinElmer Inc., Waltham, MA, Stati Uniti	incluso nel FMT2000
Microscopio fluorescente Leica DMLB	Leica, 35578 Wetzlar, Germania	DMLB
Bandelin Sonopuls HD 2070	Bandelin, 12207 Berlino, Germania	HD 2070	omogeneizzatore ad ultrasuoni
Bisturi monouso n. 10	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germania	Z692395-10EA
Forbici Metzenbaum 14cm	Ehrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, Germania	22398330
Siringa Luer Lock 5ml	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germania	Z248010
aghi per siringhe	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germania	Z192368
Falcon Tubo 50ml	BD Biosciences, Erembodegem, Belgio	Codice 352070