Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Progettazione del layout e della produzione di array personalizzati
- Genera un foglio di calcolo di sequenze peptidiche con le corrispondenti chiamate alleliche. L'array ha 20 righe e 30 colonne e può contenere fino a 20x30=600 punti per peptidi. A seconda del numero totale di peptidi registrati nella fase 1.5 da un particolare donatore, e sulla base della nostra esperienza passata con due esempi che avevamo provato, l'array di 600 spot può contenere tutte le sequenze generate da ~2 casi di trapianto separati.
- Pianificare razionalmente il modo più efficiente per adattare i set di peptidi all'interno del formato a 600 punti dell'array.
- Se più di un soggetto può entrare in un intero array, inserire righe vuote dopo le sequenze del primo donatore in modo che corrispondano al numero totale di righe che possono essere divise per 30 (il numero di punti in una riga sull'array).
- Immediatamente dopo l'ultima riga vuota per la prima serie di sequenze, incollare l'intera colonna del contenuto della sequenza del secondo caso di trapianto.
- Ripetere questi passaggi fino a quando l'array non è riempito e non è possibile aggiungere altri casi senza superare i 600 punti. Se intere righe vuote vengono lasciate da riempire in basso, "spostare" la riga vuota da posizionare tra i due set di donatori. Questo ampio spazio lasciato tra i casi facilita il taglio della membrana dopo il completamento della sintesi, seguendo il passaggio 2.2. sotto.
- Programmare le sequenze peptidiche nel contesto del layout dell'array. Il programma del sintetizzatore SPOT prende un formato di testo delle sequenze (una riga, una sequenza peptidica), che può essere ottenuto direttamente salvando il foglio di calcolo risultante dal passaggio 1.1.4 come un semplice documento di testo (senza le colonne extra per i nomi degli alleli, le posizioni aa ecc.).
- Esegui la sintesi automatizzata di array di peptidi tramite il sintetizzatore SPOT. L'intera operazione della sintesi è dettagliata in Kudithipudi et al. Si noti che la sintesi Fmoc di due array richiede ~4-5 giorni.
2. Sonda e riprova gli antisieri da una serie temporale di un singolo ricevente di trapianto.
NOTA: L'array di membrane da 600 spot ha le dimensioni ~7 cm x 13 cm. Dopo la sintesi, gli array possono essere conservati a temperatura ambiente come membrane asciutte per almeno due anni quando schermati dalla luce diretta. Evitare l'eccessiva piegatura della membrana per preservarne la longevità per un uso ripetuto.
- Reidratare l'array di membrane con etanolo e visualizzare le macchie peptidiche colorate con Ponceau S.
- Reidratare l'array di membrane che trasporta i peptidi seguendo una procedura graduale ottimizzata in Li et al.
- Immergere la membrana array in 20 mL di etanolo al 100%.
- Aggiungere 20 ml di acqua distillata per diluire la soluzione al 50% di etanolo e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti.
- Cambiare la soluzione di immersione in 40 mL di acqua al 100% tre volte e incubare 15 minuti ogni volta.
- Lavare in un tampone di lavoro adeguato, ad esempio 20 ml di TBST (soluzione salina tamponata con Tris allo 0,1%), tre volte per 5 minuti ciascuna.
- Colorazione Ponceau S dell'array per visualizzare peptidi sintetici
- Aggiungere 20 mL di soluzione pre-formulata di Ponceau S direttamente all'array idratato e incubare per ~30 s agitando.
- Far scorrere continuamente acqua distillata sulla membrana per de-macchiare il colore di fondo Ponceau S. Durante il processo, possono diventare visibili macchie peptidiche di colore rosso.
- Separare le porzioni dell'array per ciascun donatore tagliando con cura tra le sezioni dell'array per i singoli casi. Contrassegnare l'orientamento di ogni matrice.
- Matrice pre-blocco.
- Bloccare la membrana in 20 mL di latte scremato al 5% disciolto nel tampone TBST. Questa soluzione a base di latte decolorerà ulteriormente il colore Ponceau S. Sostituire più volte il tampone del latte per ottenere immagini peptidiche più chiare.
- Ai fini della registrazione, scattare una foto dell'immagine Ponceau S dell'array utilizzando una fotocamera portatile (esempio nella Figura 1).
- Continuare a bloccare la membrana nel latte scremato al 5% a 4 °C per una notte o a temperatura ambiente per 2 ore con oscillazione.
- Incubare l'array con l'antisiero per trapianto.
nota: Va notato che un fenomeno noto come prozona o effetto Hook può derivare da un'interferenza complemento-dipendente nell'analisi degli anticorpi sierici. Per aggirare questo problema, si può prendere in considerazione una fase facoltativa di pretrattamento del siero con acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) o inattivazione termica dei campioni di siero.
- Rimuovere il tampone bloccante e lavare la membrana con 20 ml di TBST tre volte il giorno successivo per 5 minuti ogni volta.
- Aggiungere 20 μL di siero grezzo del ricevente a 20 mL di latte al 2,5% in tampone TBST e incubare con la membrana per 2-3 ore a temperatura ambiente. Si noti che in questo ciclo iniziale di sondaggio, si raccomanda di utilizzare per primo l'ultimo siero post-trapianto (o probabilmente il siero più sensibilizzato) della serie temporale. Ciò si basa sul presupposto che i campioni precedenti della serie, in particolare dai punti temporali pre-trapianto, abbiano una minore varietà di alloanticorpi che tendono a svilupparsi nel tempo. In questo modo, qualsiasi possibilità di interferenza del segnale da "carry-over" tra i cicli di sondaggio può essere chiaramente distinta dalla reattività alloanticorpale veramente sviluppata a causa delle risposte immunitarie contro il trapianto.
- Lavare l'array utilizzando 20 mL di TBST e incubarlo con un anticorpo secondario.
- Lavare la membrana tre volte per 10 minuti ogni volta.
- Incubare con anticorpo secondario IgG-HRP (perossidasi di rafano) di capra alla diluizione 1:10.000 in tampone TBST integrato con latte all'1% per altre 2 ore.
- Lavare e sviluppare la macchia.
- Lavare la membrana tre volte con TBST per 10 minuti ogni volta.
- Eseguire la chemiluminescenza potenziata (ECL) utilizzando 5 mL di soluzione di luminol appena miscelata con 5 mL di soluzione di perossido per sviluppare la membrana (per 1 min).
- Visualizzare i segnali ECL utilizzando un imager adatto (ad esempio, ChemiDoc Imaging Systems o Azure C600).
- Scansiona e quantifica il blot.
- Salvare le immagini sviluppate (Figura 2, immagine in basso) ed eseguire la quantificazione dell'intensità dello spot.
3. Confronta la reattività agli antisieri in una serie temporale clinica.
- Spogliate l'array.
- A questo punto, mantenere la membrana sempre bagnata.
- Smontare la membrana incubandola con 20 mL di tampone di stripping commerciale a 37 °C per 20 minuti, quindi lavare la membrana con TBST tre volte per 10 minuti ciascuna. Quindi ripetere i passaggi di blocco (passaggio 3.2) e sondaggio (passaggio 3.3) utilizzando un siero diverso del paziente prelevato in un momento diverso.
- Membrana sverniciata a blocchi.
Nota: Dopo lo stripping, la membrana può essere riutilizzata per un altro ciclo di sondaggio di un siero diverso dello stesso paziente in una serie temporale.
- Bloccare la membrana utilizzando il tampone di latte al 5% come prima (vedere il passaggio 2.2).
- Eseguire il ririlevamento di un antisiero diverso dalla stessa serie temporale (ripetere i passaggi da 2,3 a 2,6; esempio nella Figura 2, immagine in alto).
nota: L'array strippato può quindi essere utilizzato per riprovare un altro campione di siero. Poiché i peptidi sono coniugati in modo covalente alla matrice di supporto della membrana, abbiamo dimostrato che l'array può essere riutilizzato per un massimo di 20 cicli di cicli di stripping e risonaggio senza perdere le sue prestazioni.
