Rilevamento degli anticorpi anti-glicani circolanti con un array di glicani stampato

Abstract

Fonte: Olivera-Ardid, S. et al., Printed Glycan Array: Una tecnica sensibile per l'analisi del repertorio di anticorpi anti-carboidrati circolanti in piccoli animali.J. Vis. Exp.(2019)

Questo video mostra la tecnologia di array di glicani stampati per analizzare gli anticorpi anti-glicani circolanti nel siero di topo. Gli anticorpi nel siero interagiscono con glicani specifici sul chip, il che è confermato dall'immunocolorazione seguita dalla scansione a fluorescenza.

Protocollo

Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.

1. Produzione di glicochip

1. Preparazione di microarray
   1. Stampare i glicani (50 mM) e i polisaccaridi (10 μg/mL) in soluzione salina tamponata con fosfato da 300 mM (PBS, pH 8,5) a 6 repliche su vetrini derivati da N-idrossisuccinimide, utilizzando un array robotico senza contatto (volume di gocce ~900 pL). Ogni diapositiva contiene 4 diversi blocchi di sotto-array (Figura 1A, a colori) ripetuti 6 volte. Ogni singolo sotto-array è formato da 112 diverse macchie di glicani, compresi i controlli (8 righe × 14 colonne) (Figura 1B).
      nota: Le informazioni relative ai glicani sono fornite nella Tabella 1. La libreria di glicani utilizzata per la stampa dei microchip è il risultato di uno sforzo sintetico a lungo termine del team IBCh; Esempi di sintesi sono descritti in pubblicazioni correlate. La libreria di glicani comprendeva antigeni dei gruppi sanguigni e alcuni degli oligosaccaridi terminali più frequenti, nonché motivi principali di glicoproteine e glicolipidi legati a N e O nei mammiferi, antigeni di carboidrati associati al tumore e polisaccaridi di batteri patogeni.
   2. Incubare i vetrini in una scatola di umidità (umidità relativa ~70%) a temperatura ambiente (25 °C) per 1 ora.
   3. Microarray bloccanti: incubare i vetrini per 1,5 ore con tampone bloccante a temperatura ambiente (100 mM di acido borico, 25 mM di etanolammina, 0,2% (v/v) di Tween-20 in acqua ultrapura).
   4. Lavare il glicochip con acqua ultrapura e asciugarlo all'aria.
2. Controllo qualità Glycochip
   1. Analizzare due microarray di ciascun lotto utilizzando una soluzione da 1 mg/mL di preparato di immunoglobuline complesse (CIP, contenente immunoglobuline: IgG, IgM e IgA), una soluzione da 10 μg/mL di immunoglobuline anti-umane di capra biotinilata come anticorpo secondario (IgM + IgG + IgA), seguita da 1 μg/mL del corrispondente coniugato fluorescente di streptavidina (tramite il protocollo descritto di seguito, vedere la fase 2).
   2. Scansiona e analizza i glicochip (vedi passaggio 3, analisi dell'array di glicani).
   3. Utilizzare batch di microarray con correlazione intra e inter-chip superiore a 0,9.

2. Tecnica di Matrice di Glicani

1. Preparare le seguenti soluzioni acquose (in acqua ultrapura) e conservarle a temperatura ambiente (25 °C):
   1. Tampone-1: 1% (p/v) di albumina sierica bovina (BSA) in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), 1% (v/v) Tween-20 e 0,01% (p/v) di sodio azide (NaN₃).
   2. Buffer-2: 1% (p/v) BSA in PBS, 0,1% (v/v) Tween-20 e 0,01% (p/v) NaN₃.
   3. Buffer-3: 0,1% (v/v) Tween-20 in PBS.
   4. Buffer-4: 0,001% (v/v) Tween-20 in PBS.
2. Glycochip e preparazione del campione
   1. Posizionare la scatola di conservazione con i vetrini sul tavolo fino a quando non raggiungono la temperatura ambiente (25 °C).
      nota: Utilizzare guanti in lattice senza polvere. Il glicochip deve essere manipolato dalla parte inferiore del vetrino, dove si trova il codice a barre. Il codice a barre ti aiuterà a identificare il lato destro, evitando il contatto con la superficie dove sono stampati i glicani.
   2. Aprire la scatola, prendere il glicochip e posizionarlo nella camera di incubazione (25 °C), già condizionata con carta da filtro bagnata per mantenere costante l'umidità all'interno della camera.
   3. Nel frattempo, diluire il siero per topi con Buffer-1 (1:20) in provette da 1,5 mL. Omogeneizzare la soluzione di siero (5 s) con un miscelatore a vortice.
      nota: Il volume necessario per coprire completamente la superficie di un singolo glicochip è di circa 1 ml.
   4. Dopo l'omogeneizzazione, incubare il siero diluito a 37 °C per 10 minuti a bagnomaria per evitare l'aggregazione di immunoglobuline. Centrifugare le provette per 3 minuti a 10.000 x g e 25 °C, raccogliere il surnatante ed eliminare il materiale precipitato.
   5. Posizionare con cura il glicochip nella camera di incubazione. Incubarlo per 15 minuti a 25 °C con 1 mL di Buffer-3 per eliminare qualsiasi materiale residuo sulla superficie del glicochip.
   6. Tenere il glicochip in posizione verticale e rilavarlo con alcune gocce di Buffer-3 utilizzando una pipetta di plastica Pasteur. Rimuovere con cautela il tampone dalla superficie del glicochip utilizzando carta da filtro.

3. Reazione: legame con gli anticorpi

1. Posizionare il glicochip nella camera di incubazione. Distribuire il campione di siero diluito sulla superficie del glicochip utilizzando una micropipetta. Incubare con agitazione orbitale (30 giri/min) a 37 °C per 1,5 h. Assicurarsi che tutta l'area asciutta della superficie del glicochip sia coperta dal campione di siero diluito utilizzando la punta della pipetta.
2. Rimuovere il campione in eccesso e immergere il glicochip per 5 minuti nel tampone-3 a 25 °C. Quindi, spostare il glicochip in un contenitore con Buffer-4 (5 min) e infine lavare (5 min) il glicochip con acqua ultrapura. Centrifugare il glicochip per 1 minuto a 175 x g e 25 °C per rimuovere il liquido.

4. Rilevamento: anticorpo secondario

1. Posizionare il glicochip nella camera di incubazione. Distribuire sulla superficie del glicochip una soluzione (5 μg/mL) di capra anti-topo (IgG + IgM) coniugata alla biotina in Buffer-2. Incubare con agitazione orbitale (30 giri/min) a 37 °C per 1 ora.
2. Rimuovere la frazione non legata e ripetere i passaggi di lavaggio.
3. Dopo la centrifugazione, incubare il glicochip al buio a 25 °C per 45 min (30 giri/min) con 2 μg/mL della corrispondente soluzione di streptavidina marcata con fluorocromo (nel tampone-2).
4. Al buio, rimuovere la frazione non legata e ripetere le fasi di lavaggio.
5. Asciugare il glicochip con aria.
   nota: Il glicochip deve essere scansionato il prima possibile. Ma se è impossibile eseguire la scansione subito dopo la colorazione, i glicochip possono essere conservati in un luogo fresco e asciutto al buio.

3. Analisi dell'array di glicani

1. Scansiona l'array
   1. Lasciare il glicochip sul tavolo fino a quando non raggiunge la temperatura ambiente al buio. Allo stesso tempo, accendere lo scanner per vetrini e il laser (lunghezza d'onda di eccitazione di 633 nm).
   2. Tenendo il microarray, far scorrere il glicochip nella fessura fino a toccare la parte posteriore.
   3. Scansiona il glicochip ("esegui scansione facile") e salva la scansione come ". TIFF".

Tabella 1: Elenco dei glicani, il loro legame con gli anticorpi circolanti naturali (IgM + IgG) dei topi BALB/c (n = 20), espressi in unità di fluorescenza relativa (RFU) come mediana ± MAD, e il numero di animali che superano il limite (≥4000 RFU). Questa tabella è stata riprodotta da Bello-Gil, D. et al. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Risultati

Figura 1: Rappresentazione schematica (non su scala) della configurazione, della stampa e dell'analisi dell'array di glicani.(A) I microchip stampati sono sviluppati con una libreria di 419 diverse strutture di glicani, seguiti dalla rilevazione con un anticorpo secondario marcato in fluorescenza appropriato. Ogni diapositiva contiene 4 diversi blocchi di sotto-array (a colori), ripe...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
anticorpi
Igs anti-umani di capra biotinilata	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Stati Uniti	Codice #: 31782
IgM + IgG biotinilate di capra	Thermo Fisher Scientifico	Codice #: 31807
attrezzatura
Arrayer robotizzato sciFLEXARRAYER S5	Scienion AG, Berlino, Germania	http://www.scienion.com/products/sciflexarrayer/
Vassoio per coloranti (camera di incubazione dei vetrini)	Simport, Beloeil, QC, Canada	Codice #: M920-2
centrifuga	Eppendorf, Amburgo, Germania	Rif. #: 5810 R
Pipette	Gilson, Middleton, Wisconsin, Stati Uniti	http://www.gilson.com/en/Pipette/
Scanner per diapositive	PerkinElmer, Waltham, MA, Stati Uniti	ScanArray GX Plus
Incubatore a scuotimento	Cole-Parmer, Staffordshire, Regno Unito	Rif. #: SI50
Campioni biologici
BALB/c topi sera	Questo documento	N/ A
Preparazione di immunoglobuline complesse (CIP)	Immuno-Gem, Mosca, Federazione Russa	http://www.biomedservice.ru/price/goods/1/17531
Sostanze chimiche, reagenti e glicani
Libreria di glicani	Istituto di Chimica Bioorganica (IBCh), Mosca, Russia	N/ A
Albumina sierica bovina (BSA)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,	Rif. #: A9418
Etanolammina	Sigma-Aldrich	Codice #: 411000
Interpolazione-20	Merck Chemicals & Life Science S.A., Madrid, Spagna	Rif. #: 655204
Soluzione salina tamponata con fosfata (PBS)	VWR International Eurolab S.L, Barcellona, Spagna	Rif. #: E404
Aziduro di sodio	Sigma-Aldrich	Rif. #: S2002
Streptavidina Alexa Fluor 555 coniugato	Thermo Fisher Scientifico	Rif. #: S21381
Streptavidina Cy5 coniugato	GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, Regno Unito	Rif. #: PA45001
materiali
Vetrini derivatizzati N-idrossisuccinimide H	Schott-Nexterion, Jena, Germania	Rif. #: 1070936
Carta da filtro Whatman	Sigma-Aldrich	Rif. #: WHA10347509
Provette da 1,5 mL	Eppendorf	Rif. #: 0030120086
Software e algoritmi
Sistema di analisi per microarray ScanArray Express	PerkinElmer	http://www.per kinelmer.com/microarray