$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Progettare il layout della diapositiva dell'array e della piastra sorgente
- Sotto l'intestazione "Pianifica un layout di diapositiva" nell'interfaccia di ArrayNinja, fai clic sul collegamento che corrisponde alla stampante di microarray in uso.
nota: ArrayNinja è stato programmato per imitare il movimento robotico di due stampanti microarray di uso comune (vedi Tabella 1). La compatibilità con gli altri arrayer può essere configurata su richiesta.
- Fare clic all'interno della finestra di dialogo "Carica piastra", digitare "vuoto" e fare clic su "invio". Vedere la Figura 1 per uno screenshot del modulo di progettazione ArrayNinja.
- Regolare il diametro dello spot a 275 μm e la spaziatura dello spot a 375 μm. Regolare le impostazioni rimanenti (Blocchi di piastre/fila di piastre, Totale file di piastre, repliche, funzioni in y, Super Array, SuperA fudge; vedere la Figura 1) per personalizzare l'aspetto delle funzioni sulla diapositiva del microarray.
nota: Il diametro dello spot è determinato dalla dimensione del pin del microarray. Man mano che queste impostazioni vengono regolate, la diapositiva del cartone animato si aggiornerà in tempo reale. Usa questo cartone animato per visualizzare in anteprima il modo in cui ogni impostazione modifica il layout finale della diapositiva.
- Dopo aver finalizzato il layout delle funzioni nella diapositiva, passare il mouse su ciascuna funzione univoca e immettere l'identificatore della funzione nella finestra di dialogo popup.
nota: Gli identificatori di funzionalità possono essere costituiti da numeri, lettere o combinazioni. Questa operazione è necessaria solo per le funzionalità univoche e non viene visualizzata una finestra di dialogo quando si selezionano le repliche.
- Dopo che a tutte le caratteristiche uniche è stato assegnato un identificatore, fai clic su "Compila". Inserisci un nome per il layout della diapositiva e fai clic su "stampa la tua targa" per salvare. Si aprirà una nuova pagina che mostra il numero di piastre sorgente a 384 pozzetti necessarie per fabbricare il design del vetrino scelto e una tabella che mappa la posizione fisica di ciascuna caratteristica da caricare nelle piastre sorgente.
nota: Ricorda questo nome, poiché verrà utilizzato per richiamare questo design durante l'analisi dei dati dei microarray. Facendo clic su "stampa la tua targa" si salva il layout all'interno di ArrayNinja.
2. Fabbricazione di Microarray
- Preparazione della piastra sorgente
- Utilizzare la mappa generata con ArrayNinja per creare le piastre sorgente a 384 pozzetti.
NOTA: Descrizioni dettagliate dei peptidi interrogati su questa piattaforma possono essere trovate altrove.
- Depositare 1 - 2 μL di ciascuna caratteristica (ad esempio, peptide istonico biotinilato) nel pozzetto corretto della piastra sorgente a 384 pozzetti.
nota: I peptidi istonici biotinilati sono tipicamente depositati da 200 a 400 μM di soluzioni stock, il che equivale a un eccesso molare da 10 a 25 volte dei siti di legame del peptide rispetto alla streptavidina in un singolo punto di array. Questo viene calcolato utilizzando l'equazione:
dove V è il volume erogato da uno spillo, [P] è la concentrazione dell'elemento da stampare, NA è il numero di Avogadro e S è la superficie di un punto. C è la copertura del vetrino, espressa come il numero di molecole di streptavidina per unità di area moltiplicato per tre (il numero medio di siti di legame disponibili per la streptavidina). V e C sono ottenuti dai rispettivi produttori. Altre caratteristiche possono richiedere concentrazioni diverse a seconda delle dimensioni della biomolecola, dove l'affollamento può essere un problema. Per determinare la concentrazione di stampa ottimale, è necessario testare empiricamente una gamma di concentrazioni di stampa per ogni nuovo tipo di funzione.
- Diluire ogni caratteristica 10 volte con 1 tampone di stampa integrato con albumina sierica bovina (BSA) all'1%. Centrifugare la/e piastra/e sorgente/i a 500 x g per 2 minuti a temperatura ambiente.
nota: Si raccomanda l'inclusione di biotina marcata con fluoresceina (5 μg/μL) nel tampone di stampa come controllo dello spotting e come aiuto visivo per facilitare il corretto allineamento dell'array durante l'analisi (vedere la Figura 3).
- Protocollo di stampa (Figura 2A – B).
- Preparare l'arrayer svuotando il contenitore di raccolta dei rifiuti e riempiendo il contenitore della soluzione di lavaggio e il contenitore dell'umidificatore con acqua distillata sterile.
- Inserire i parametri utilizzati per progettare la diapositiva in ArrayNinja (Figura 1) nel programma di controllo della stampante microarray.
- Utilizzando il programma di controllo della stampante microarray, impostare la procedura di lavaggio per un lavaggio di 1 s con un'immersione. Impostare le impostazioni post-lavaggio per immergere nuovamente i perni 5 volte dopo ogni lavaggio. Impostare l'umidità su 60%.
nota: La configurazione di lavaggio ottimale può variare a seconda della stampante microarray utilizzata. La configurazione ottimale del pin dip post-lavaggio può variare a seconda della stampante microarray utilizzata.
- Inserire i vetrini funzionalizzati (ad es. vetro rivestito di streptavidina) nelle piastre del substrato e posizionare tutte le piastre nell'elevatore delle piastre. Inserire la/e piastra/e sorgente/i nel/e portatarga e posizionarla nell'elevatore della piastra sorgente.
- Fai clic su "stampa". Monitorare il processo di stampa per alcuni cicli di deposizione delle caratteristiche per assicurarsi che tutte le impostazioni di lavaggio e immersione siano corrette. Al termine della tiratura di stampa, rimuovere le piastre del supporto di stampa dall'arrayer.
nota: Quando le grandi tirature impediscono il completamento delle fasi di blocco entro un giorno, i vetrini stampati possono essere incubati in una camera umidificata a 4 °C per una notte. Incubare i vetrini accanto a un piccolo bicchiere d'acqua all'interno di una scatola di cartone sigillata con pellicola trasparente.
- Bloccare i vetrini con il tampone di blocco per 30 minuti a temperatura ambiente mescolando.
- Lavare i vetrini 2 x 10 min a temperatura ambiente in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), pH 7,6 con miscelazione. Asciugare i vetrini centrifugandoli in una centrifuga per vetrini microarray per 30 s a temperatura ambiente.
nota: Per l'elaborazione di un gran numero di vetrini contemporaneamente, è possibile utilizzare una camera di lavaggio dei vetrini per microscopio ad alta produttività, che consente di lavare 50 vetrini in parallelo.
- Per i vetrini progettati per essere divisi con cera, procedere alla sezione 2.1. Per tutti gli altri modelli, conservare i vetrini a 4 °C al riparo dalla luce e dall'umidità.
nota: I peptidi istonici biotinilati stampati sono stabili per almeno 6 mesi se conservati in questo modo.
2. Partizionamento dei vetrini di microarray
- Penna a cera idrofobica (Figura 2C)
- Applicare la cera intorno alle aree che contengono le caratteristiche usando una penna per cera. Lasciare asciugare la cera all'aria per 5 minuti prima di procedere alla sezione 3.
nota: Dopo il blocco, i punti dell'array possono essere molto difficili da visualizzare a occhio. Il design della diapositiva di ArrayNinja può essere stampato in scala e utilizzato come guida per l'applicazione della cera.
- Guarnizione in silicone (Figura 2D)
- Staccare la pellicola trasparente dal retro della guarnizione dell'array e posizionare il lato adesivo rivolto verso il basso sul vetrino del microarray.
- Tenere la guarnizione in posizione per 5 s prima di procedere alla sezione 3.
- Impronta in cera (Figura 2E)
- Per i vetrini progettati per essere divisi con cera, stampare un vetrino di prova su vetro liscio utilizzando il 10% di BSA. Utilizzare questo vetrino di prova per ottimizzare le guide della stampante per cera o le impostazioni dell'array per garantire che tutte le funzioni siano all'interno delle camere dello stampo in cera.
- Riscaldare l'imprinter per cera microarray a 85 °C fino a quando tutta la cera non si è completamente sciolta, circa 30 minuti.
- Inserire la diapositiva con il lato stampato rivolto verso il basso e spingerla fino alla guida destra sulla stampante per microarray. Tirare verso l'alto la leva per portare lo stampo a contatto con la superficie del vetrino. Tenere premuto per 2 s.
nota: Il tempo di tenuta può essere modificato per ottenere uno spessore ottimale del bordo della cera.
- Rimuovere rapidamente il vetrino e ispezionare visivamente i bordi di cera per assicurarsi che tutti i pozzetti siano chiusi e che i bordi non siano così spessi da invadere i punti. Conservare i vetrini a 4 °C al riparo dall'umidità e dalla luce.
nota: Il tempo di tenuta può essere aumentato o diminuito per ottenere bordi più spessi o più sottili.
3. Ibridazione di un anticorpo PTM istonico con un microarray di peptidi
- Preparare il tampone di ibridazione (PBS, pH 7,6, 5% BSA, 0,1% Tween-20).
- Equilibrare il vetrino nel tampone di ibridazione utilizzando un recipiente di ibridazione. Coprire completamente l'intero vetrino con tampone di ibridazione e incubare per 30 minuti a 4 °C su un agitatore orbitale a bassa velocità.
- Preparare una soluzione contenente l'isteroide PTM diluito nel tampone di ibridazione.
nota: Nei dati di esempio, sia l'icorpo #1 che l'anticorpo #2 sono stati diluiti 1:1.000 in tampone di ibridazione. Si raccomanda come punto di partenza un intervallo di diluizione simile a quello utilizzato per l'immunoblotting.
- Incubare l'array con la soluzione di anticorpi per 1 ora a 4 °C. Rimuovere la soluzione di anticorpi e lavare l'array 3 volte per 5 minuti a 4 °C con PBS freddo, pH 7,6.
- Preparare una diluizione 1:5.000 - 1:10.000 di anticorpo secondario coniugato con colorante fluorescente in tampone di ibridazione.
- Incubare l'array con una soluzione di anticorpi secondari per 30 minuti a 4 °C al riparo dalla luce. Rimuovere la soluzione di anticorpi secondari e lavare il vetrino del microarray 3 volte per 5 minuti a 4 °C con PBS, pH 7,6. Immergere il microarray in una provetta conica da 50 ml contenente 0,1x PBS, pH 7,6 per rimuovere il sale in eccesso a temperatura ambiente. Asciugare il vetrino in una centrifuga per vetrini microarray a temperatura ambiente.
- Scansiona il vetrino con uno scanner per microarray con una risoluzione di 25 μm o superiore, seguendo il protocollo di scansione consigliato dal produttore dello scanner per microarray.
nota: Se è presente un tracciante di biotina marcato con fluoresceina, eseguire la scansione sia del canale verde (es: 488 nm, em: 509 nm) che del canale che corrisponde all'anticorpo secondario coniugato con colorante fluorescente, tipicamente rosso (es: 635 nm, em: 677 nm). L'obiettivo della scansione è quello di ottenere file di .tif a canale singolo che possono essere uniti in un unico file .png.
