1. Preparazione di embrioni di zebrafish
- Allestisci vasche di attraversamento dei pesci nel pomeriggio prima delle 17:00, con un pesce selvatico femmina e un pesce Tg maschio [ef1a:Myr-Tdtomato] utilizzando divisori per separarli in ogni vasca.
- Rimuovere i divisori prima delle 11:00 da tutti i serbatoi di attraversamento la mattina successiva. Stai zitto e non disturbare i pesci durante l'accoppiamento. La deposizione delle uova avviene in genere entro 30 minuti dalla rimozione dei divisori. Le uova fecondate rimangono sul fondo della vasca.
- Raccogli le uova fecondate dalle vasche con un filtro a rete. Trasferisci gli ovuli lavandoli in una capsula di Petri piena di acqua d'uovo ed esamina gli embrioni al microscopio da dissezione con un ingrandimento da 10x a 20x.
- Trasferire gli embrioni fecondati in una Petridish pulita contenente circa 20 ml di terreno embrionale (100 ml di soluzione madre 1.000x contengono 29,4 g di cloruro di sodio (NaCl), 1,27 g di cloruro di potassio (KCl), 4,85 g di cloruro di calcio diidrato (CaCl2,2H 2O) e 8,13 g di solfato di magnesio eptaidrato (MgSO4,7H 2O)) con pipette Pasteur in vetro di grande diametro. Conservare gli embrioni a 28 °C. Conservare 50 embrioni fecondati per piastra di Petri con 30 ml di terreno embrionale a 28,5 °C.
NOTA: Una coppia di pesci produce normalmente 100-300 embrioni e il tasso di fecondazione e sopravvivenza degli embrioni sani è superiore al 95% per ogni accoppiamento.
- La mattina successiva, togli gli embrioni dall'incubatrice alle 8:00, quando gli embrioni hanno raggiunto lo stadio di sviluppo di ~18-20 ore dopo la fecondazione (hpf). Osservali al microscopio a epifluorescenza con un ingrandimento di 20x, utilizzando inizialmente la luce bianca. A quel tempo, gli embrioni di zebrafish sono allo stadio di 20 somiti.
- Scartare gli embrioni morti che sono torbidi o rotti al microscopio utilizzando una pipetta di vetro.
- Accendere la lampada fluorescente e scegliere l'impostazione del filtro RFP (Red Fluorescent Protein) del microscopio. Quindi, seleziona gli embrioni con una forte fluorescenza rossa e trasferiscili in un nuovo piatto con acqua d'uovo.
- Dechorionare manualmente gli embrioni con due pinze sottili (le punte delle pinze devono essere affilate e non danneggiate) sotto luce bianca (Tabella dei materiali).
- Tenere il corion con un paio di pinze e fare uno strappo nel corion con le altre pinze. Apri con cura lo strappo usando la pinza e rendilo abbastanza grande da consentire il passaggio dell'embrione spingendo delicatamente l'embrione con le punte delle altre pinze.
- Trasferire gli embrioni dechorionati in una nuova capsula di Petri con terreno embrionale fresco per un rapido risciacquo prima della microiniezione.
2. Preparazione della microiniezione
- Utilizzare i capillari (diametro esterno 1,2 mm, diametro interno 0,9 mm, con filamento) per estrarre gli aghi per iniezione fine su un estrattore. Progetta e ottimizza il programma di trazione secondo il manuale.
- Aprire la punta dell'ago con una pinza sotto un microscopio a stereodissezione. Rendere il diametro della punta di circa 10 μm e l'angolo di conicità di circa 30°.
- Coniugare l'anticorpo monoclonale anti-Dld di topo con l'anti-IgG-Atto647N di topo prima dell'iniezione.
- Per ogni esperimento di iniezione, miscelare 0,5 μL dell'anticorpo anti-Dld (0,5 mg/mL) con 2 μL dell'anticorpo anti-Topo-IgG-Atto647N (1 mg/mL) mediante pipettaggio 5-10 volte. Quindi, incubare a temperatura ambiente per almeno 30 minuti (o su ghiaccio per 2-3 ore).
- Dopo l'incubazione, aggiungere 2,5 μL di tampone bloccante (10 mg/mL di IgG di topo) e 0,5 μL di rosso fenolo allo 0,5% alla miscela di anticorpi e pipettare 10 volte per miscelare accuratamente per bloccare eventuali anticorpi non coniugati rimasti nella miscela.
nota: Per ogni prova, preparare una miscela extra senza l'anticorpo anti-Dld e usarla come controllo.
- Preparare l'agarosio a basso punto di fusione all'1% nel terreno embrionale. Scaldare la miscela contenente agarosio a 70 °C fino a quando la miscela diventa trasparente.
- Aliquotare la soluzione di agarosio in provette da microcentrifuga da 2 mL. Conservare le aliquote in un blocco termico a ~40 °C.
- Sciacquare l'embrione nella provetta contenente l'1% di agarosio a basso punto di fusione per 3 s.
- Posizionare l'embrione su un coperchio di Petri di plastica rovesciato insieme a singole gocce di agarosio (~30-40 μL) per montare ogni embrione separatamente sul coperchio, come mostrato nella Figura 1. Deporre gli embrioni lateralmente nell'agarosio e mantenere questa posizione fino a quando l'agarosio non si è solidificato a temperatura ambiente.
- Monta 12 embrioni in tre file uno per uno come sopra. Coprire tutti gli embrioni montati nell'agarosio con mezzo di uova.
3. Microiniezione
- Mettere gli embrioni incorporati sotto lo stereomicroscopio e coprire l'agarosio con acqua d'uovo.
- Posizionare l'iniettore di pressione dell'aria insieme ai micromanipolatori, posizionandoli vicino ai microscopi come mostrato nella Figura 1. Utilizzare la bombola del gas in acciaio contenente azoto gassoso (N2) ad alta pressione come risorsa aria.
- Aprire la valvola del gas solo dopo che gli embrioni sono stati montati nell'agarosio. Quindi, caricare frontalmente l'ago di vetro preparato con 2 μL di miscela di anticorpi sul micromanipolatore, come mostrato nella Figura 1, quando si utilizza il modulo di riempimento frontale del microiniettore.
- Regolare la pressione di ingresso su ~80-90 psi e la pressione di iniezione su ~20 psi.
- Tarare il volume di iniezione utilizzando un micrometro al microscopio, come descritto in precedenza. Impostare la durata del tempo di sintonizzazione da 10 ms a 120 ms, in base alle dimensioni dell'apertura dell'ago. Erogare ogni impulso di iniezione toccando la paletta. Regolare il volume di iniezione di ciascuna erogazione su ~4-5 nL.
- Infilare la punta dell'ago per microiniezione attraverso la placca dorsale del tetto del rombencefalo posteriore al punto di cerniera r0/r1 e iniettare circa 10 nL (due o tre impulsi) di miscela di anticorpi senza colpire il tessuto cerebrale. Osservare il flusso di fluidi rossi nel ventricolo cerebrale.
nota: Il ventricolo rombencefalico è posteriore al confine del mesencefalo. La miscela di anticorpi iniettata contenente rosso fenolo riempie immediatamente il ventricolo cerebrale dal rombencefalo al proencefalo diffondendosi con il liquido cerebrospinale.
- Dopo l'iniezione, rimuovere rapidamente la punta dell'ago dall'embrione ruotando la manopola del micromanipolatore. Per un'iniezione di successo, il colorante rosso della miscela iniettata rimane stabilmente nel ventricolo cerebrale senza fuoriuscire nell'agarosio circostante.
- Spostare la piastra di montaggio sotto il microscopio per individuare un altro embrione montato in una posizione adatta per le ripetizioni.
- Dopo aver iniettato da sei a otto embrioni, sbucciare l'agarosio con una bisturi microchirurgica per liberare gli embrioni dall'agarosio incorporato. Trasferisci gli embrioni microiniettati in un piatto fresco con 30 ml di terreno embrionale e mettili a temperatura ambiente per i passaggi successivi.
4. Montaggio e imaging live time-lapse
- Dopo 30 minuti, trasferire gli embrioni selezionati in 10 ml di terreno embrionale. Aggiungere 420 μL di stock di tricaina (4 mg/mL) a 10 mL di terreno embrionale per anestetizzare gli embrioni.
- Per montare gli embrioni, preparare l'agarosio a basso punto di fusione allo 0,8% contenente la stessa concentrazione di tricaina nel tubo. Conservare le aliquote in un blocco termico a ~40 °C.
- Utilizzare una pipetta di vetro per immergere gli embrioni iniettati nell'agarosio caldo per 3 secondi. Quindi, rimuovere immediatamente gli embrioni dall'agarosio con la stessa pipetta di vetro e posizionare gli embrioni al centro di piastre di coltura con fondo di vetro da 35 mm con una goccia di agarosio dalla provetta. Metti solo un embrione per goccia sul bicchiere.
- Orientare delicatamente gli embrioni con una sonda in fibra o una punta di carico per mantenere il lato dorsale del cervello embrionale il più vicino possibile al fondo di vetro. Regolare delicatamente la posizione dell'embrione per estendere l'embrione senza arricciarsi mentre l'agarosio si solidifica gradualmente.
- Successivamente, controlla la posizione dell'embrione capovolgendo il piatto con fondo di vetro. Assicurarsi che l'intero proencefalo dorsale con gli embrioni montati correttamente possa essere visto al microscopio.
- Aggiungere 2-3 ml di terreno embrionale preriscaldato a 28,5 °C contenente tricaina per coprire l'embrione. Posizionare correttamente la piastra sul tavolino a temperatura controllata del microscopio confocale, come mostrato nella Figura 1. Regolare la temperatura della camera di imaging in modo che sia a 28,5 °C. L'embrione è ora pronto per l'imaging.
