Immunolocalizzazione delle proteine dell'arabinogalattano e delle pectine nei tessuti vegetali

Abstract

Fonte: Costa, M., et al. Immunolocalizzazione fluorescente di proteine arabinogalattano e pectine nella parete cellulare dei tessuti vegetali. J. Vis. Exp. (2021).

Questo video dimostra una tecnica di immunocolorazione per localizzare le proteine arabinogalattano (AGP) e le pectine nei tessuti vegetali. Le sezioni di tessuto vegetale fissate e incorporate in resina vengono colorate con anticorpi primari e secondari fluorescenti specifici per AGP e pectina e un colorante fluorescente legante la cellulosa per rivelare la loro colocalizzazione tessuto-specifica nella parete cellulare.

Protocollo

1. Immunolocalizzazione

NOTA: La procedura di immunolocalizzazione fluorescente si basa sull'uso sequenziale di due anticorpi. L'anticorpo primario viene sollevato contro uno specifico antigene bersaglio. L'anticorpo secondario viene sollevato specificamente contro l'anticorpo primario e per le tecniche fluorescenti viene coniugato a un fluoroforo (FITC [isotiocianato di fluoresceina] in questo protocollo specifico). L'anticorpo primario sarà utilizzato per rilevare l'antigene bersaglio nel campione e l'anticorpo secondario sarà utilizzato per contrassegnare la posizione in cui l'anticorpo primario si è colle....

Risultati

Figura 1. (A) Rappresentazione schematica della sequenza di rifilatura del blocco per la preparazione del campione (blocco giallo) per il sezionamento con l'ultramicrotomo. In primo luogo, la capsula di gelatina viene rimossa (1). Quindi vengono prima rifilati con un angolo di 40°-45° rispetto ai lati della capsula tangenzialmente al campione (2), un secondo taglio viene eseguito a 90° del primo (3) .......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Vetrini di reazione in vetro a 8 pozzetti	Marinfeld	MARI1216750	Possono essere utilizzate altre marche
Produzione di anticorpi IgG (molecola di wole)-FITC anti-ratto in GOAT	Sigma-Aldrich	Codice: F6258
Vetrini coprioggetto, 24 mm x 50 mm	Marinfeld	MARI0100222	Il vetrino coprioggetti dovrebbe coprire tutti i pozzetti. Possono essere utilizzate altre marche
ddH2O	Na	Na
Etanolo assoluto	Na	Na
Brillantante fluorescente 28	Sigma-Aldrich	F-6259
Latte scremato in polvere	Nestlé	Na	Il latte in polvere scremato è adeguato
forno	Na	Na	forno da laboratorio generico
Anticorpo monoclonale generato da ratto	Sonde per impianti	Na	Diversi anticorpi che riconoscono i componenti della parete cellulare sono disponibili sia presso il centro di ricerca sui carboidrati complessi (CCRC, Georgia University USA) che presso le sonde vegetali (Paul Knox Cell Wall Lab, presso l'Università di Leeds nel Regno Unito). Un breve elenco di alcuni MAB di uso comune e dove possono essere acquistati è presentato nella Tabella supplementare 1
microscopio a epifluorescenza verticale con filtri a fluorescenza UV e FITC	Microsistemi Leica	DMLb
camera di vuoto	Na	Na
pompa per vuoto	Na	Na
Vectashield	Laboratori vecta	T-1000	Possono essere utilizzati altri anti-sbiadimento. Si prega di verificare la compatibilità con FITC e il brillantante fluorescente 28. (Nota: per un'alternativa non commerciale, (vedi Jonhson et al 198218) Un mezzo antidissolvenza può essere prodotto mescolando 25 mg/mL di 1,4-Diazobiciclo-(2,2,2)ottano (DABCO) in glicerolo 9:1 (v/v) a 1xPBS. Regolare il pH a 8,6 con HCl diluito.)