Immunolocalizzazione delle proteine dell'arabinogalattano e delle pectine nei tessuti vegetali

Abstract

Fonte: Costa, M., et al. Immunolocalizzazione fluorescente di proteine arabinogalattano e pectine nella parete cellulare dei tessuti vegetali. J. Vis. Exp. (2021).

Questo video dimostra una tecnica di immunocolorazione per localizzare le proteine arabinogalattano (AGP) e le pectine nei tessuti vegetali. Le sezioni di tessuto vegetale fissate e incorporate in resina vengono colorate con anticorpi primari e secondari fluorescenti specifici per AGP e pectina e un colorante fluorescente legante la cellulosa per rivelare la loro colocalizzazione tessuto-specifica nella parete cellulare.

Protocollo

1. Immunolocalizzazione

NOTA: La procedura di immunolocalizzazione fluorescente si basa sull'uso sequenziale di due anticorpi. L'anticorpo primario viene sollevato contro uno specifico antigene bersaglio. L'anticorpo secondario viene sollevato specificamente contro l'anticorpo primario e per le tecniche fluorescenti viene coniugato a un fluoroforo (FITC [isotiocianato di fluoresceina] in questo protocollo specifico). L'anticorpo primario sarà utilizzato per rilevare l'antigene bersaglio nel campione e l'anticorpo secondario sarà utilizzato per contrassegnare la posizione in cui l'anticorpo primario si è collegato al campione dopo aver lavato via l'eccesso di anticorpo primario. I controlli sono una parte importante di questo test e devono essere sempre eseguiti per assicurare l'accuratezza delle osservazioni. Un pozzetto sul vetrino deve essere riservato per l'uso come controllo negativo, dove il trattamento con anticorpi primari verrà saltato, e quindi non deve essere osservato alcun segnale alla fine dell'esperimento. Un controllo positivo deve essere incluso nell'esperimento trattando un pozzetto con un anticorpo la cui marcatura è già nota e certa. Il controllo positivo viene utilizzato per confermare l'efficacia della marcatura degli anticorpi secondari e le condizioni di reazione, mentre il controllo negativo verifica la specificità degli anticorpi secondari.

1. Preparare una camera di incubazione posizionando alcuni tovaglioli di carta inumiditi sul fondo di una scatola di puntali per pipette e avvolgendola con carta stagnola (Figura 1B-1E). Posizionare i vetrini nella camera di incubazione.
2. Pipettare una goccia da 50 μl per 8 mm di pozzetto di soluzione bloccante (5% di latte scremato in polvere (p/v) in soluzione salina tamponata con fosfato 1 M [PBS]) e incubare per 10 minuti. Rimuovere la soluzione bloccante e lavare tutti i pozzetti due volte con PBS per 10 minuti.
3. Preparare le soluzioni anticorpali primarie (vedere la Tabella 1), anticorpo 1:5 (v/v) in soluzione bloccante; fare una stima di circa 40 μl per pozzetto da 8 mm.
   nota: La concentrazione dell'anticorpo deve essere regolata secondo il protocollo del produttore.
4. Eseguire un lavaggio finale con acqua bidistillata (ddH₂O) per 5 min, non lasciare mai asciugare completamente i pozzetti.
5. Pipettare la soluzione di anticorpi primari nei pozzetti di reazione. Pipettare la soluzione bloccante nei pozzetti di controllo.
6. Chiudere la camera di incubazione e lasciar riposare per 2 ore a temperatura ambiente, seguite da una notte a 4 °C. Preparare la soluzione di anticorpi secondari, all'1% in soluzione bloccante (v/v) a circa 40 μL per pozzetto. Tenetelo coperto con carta stagnola.
7. Lavare tutti i pozzetti due volte con PBS per 10 minuti, seguiti da altri 10 minuti con ddH₂O. Assicurarsi che non siano visibili tracce della soluzione bloccante o depositi sui pozzetti.
8. Pipettare la soluzione di anticorpi secondari in tutti i pozzetti. D'ora in poi, proteggi le guide dalla luce.
9. Incubare per 3–4 ore al buio a temperatura ambiente.
10. Lavare tutti i pozzetti due volte per 10 minuti con PBS seguito da un altro lavaggio di 10 minuti con ddH₂O.
11. Applicare una goccia di calcofluor (1:10.000 (p/v) fluorescente più luminoso di 28 in PBS) su ciascun pozzetto. Senza lavare, applicare una goccia di mezzo di montaggio (vedi Tabella dei materiali) su ciascun pozzetto e posizionare un vetrino coprioggetti (Figura 2H).
12. Osservare con un microscopio a fluorescenza, dotato di lenti 10x/0,45, 20x/0,75, 40x/0,95 e 100x/1,40, utilizzare filtri UV (per la colorazione del calcofluor) e FITC, per rilevare rispettivamente la parete cellulare e l'immunolocalizzazione (Figura 2I). Utilizzare le seguenti lunghezze d'onda: eccitazione/emissione (nm) 358/461 per UV e 485/530 per FITC.
13. Per una migliore visualizzazione dei risultati, sovrapporre entrambe le immagini con ImageJ o simili.

Tabella 1: Elenco di anticorpi monoclonali utili. La tabella sopra rappresenta un esempio di anticorpi disponibili, con informazioni sui loro bersagli e dove possono essere acquistati.

Visualizzazione del materiale Visualizzazione del materiale

nome	affinità	Disponibile all'indirizzo
Testo della LM2	Proteina arabinogalattano	Sonde per impianti (Leeds, Regno Unito)
Motore LM5	pectine
Motore LM6	Arabinan
Motore LM7	Omogalatturico
Visualizzazione del materiale LM8	Xilogalacturonan
Pannello LM13	(1-5)-a-L-ARABINAN
Pannello LM14	Proteina arabinogalattano
LM16	Arabinan Lavorato - RG-I
LM18	Omogalatturico
LM19	Omogalatturico
Pannello LM20	Omogalatturico
Pannello LM26	GALATTANO RAMIFICATO
Pannello LM30	Proteina arabinogalattano
JIM5	Omogalatturonano a basso estere metilico	CCRC (Georgia, Stati Uniti)
JIM7	Omogalatturonano altamente esterificato metilico
JIM4	Proteina arabinogalattano
JIM8	Proteina arabinogalattano
JIM13	Proteina arabinogalattano
JIM15	Proteina arabinogalattano
JIM16	Proteina arabinogalattano
JIM20	Estensina
MAC207	Proteina arabinogalattano

Risultati

Figura 1. (A) Rappresentazione schematica della sequenza di rifilatura del blocco per la preparazione del campione (blocco giallo) per il sezionamento con l'ultramicrotomo. In primo luogo, la capsula di gelatina viene rimossa (1). Quindi vengono prima rifilati con un angolo di 40°-45° rispetto ai lati della capsula tangenzialmente al campione (2), un secondo taglio viene eseguito a 90° del primo (3) ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Vetrini di reazione in vetro a 8 pozzetti	Marinfeld	MARI1216750	Possono essere utilizzate altre marche
Produzione di anticorpi IgG (molecola di wole)-FITC anti-ratto in GOAT	Sigma-Aldrich	Codice: F6258
Vetrini coprioggetto, 24 mm x 50 mm	Marinfeld	MARI0100222	Il vetrino coprioggetti dovrebbe coprire tutti i pozzetti. Possono essere utilizzate altre marche
ddH2O	Na	Na
Etanolo assoluto	Na	Na
Brillantante fluorescente 28	Sigma-Aldrich	F-6259
Latte scremato in polvere	Nestlé	Na	Il latte in polvere scremato è adeguato
forno	Na	Na	forno da laboratorio generico
Anticorpo monoclonale generato da ratto	Sonde per impianti	Na	Diversi anticorpi che riconoscono i componenti della parete cellulare sono disponibili sia presso il centro di ricerca sui carboidrati complessi (CCRC, Georgia University USA) che presso le sonde vegetali (Paul Knox Cell Wall Lab, presso l'Università di Leeds nel Regno Unito). Un breve elenco di alcuni MAB di uso comune e dove possono essere acquistati è presentato nella Tabella supplementare 1
microscopio a epifluorescenza verticale con filtri a fluorescenza UV e FITC	Microsistemi Leica	DMLb
camera di vuoto	Na	Na
pompa per vuoto	Na	Na
Vectashield	Laboratori vecta	T-1000	Possono essere utilizzati altri anti-sbiadimento. Si prega di verificare la compatibilità con FITC e il brillantante fluorescente 28. (Nota: per un'alternativa non commerciale, (vedi Jonhson et al 198218) Un mezzo antidissolvenza può essere prodotto mescolando 25 mg/mL di 1,4-Diazobiciclo-(2,2,2)ottano (DABCO) in glicerolo 9:1 (v/v) a 1xPBS. Regolare il pH a 8,6 con HCl diluito.)