1. Precauzioni di sicurezza
NOTA: Questo metodo è applicabile sia al virus vivo della rabbia (RABV) che al vaccino inattivato.
- Utilizzare le buone pratiche di laboratorio e le procedure di sicurezza.
- Indossare adeguati dispositivi di protezione individuale (DPI) tra cui camice monouso, guanti, mascherine, occhiali, ecc.
- Quando il virus vivo viene titolato, utilizzare una cappa di sicurezza biologica di classe II.
- Considerare qualsiasi materiale a contatto con i campioni (reagenti, soluzioni di lavaggio, ecc.) come materiale infettivo.
- Trattare il materiale contaminato immergendolo nella soluzione di candeggina (2,5% di ipoclorito di sodio) per 30 minuti per la decontaminazione.
- Maneggiare le sostanze chimiche in conformità con le buone pratiche di laboratorio.
2. Preparazione
- Utilizzare reagenti di grado analitico ove possibile.
- Preparare le soluzioni fresche del tampone di rivestimento/tampone carbonato, del tampone di passivazione, del diluente e del tampone citrato (Tabella 1), filtrare con filtri da 0,45 o 0,22 μm e conservare a 4 °C per un giorno prima dell'uso per preservarne la purezza analitica.
- Lasciare che i reagenti raggiungano la temperatura ambiente (da +18 °C a +25 °C) 30 minuti prima dell'uso e omogeneizzare mescolando delicatamente prima dell'uso.
3. Sensibilizzazione con micropiastre
NOTA: Utilizzare piastre per immunodosaggio ad adsorbimento a 96 pozzetti ottimizzate per legare elevate quantità di immunoglobuline (ad esempio, vedere la Tabella dei materiali).
- A ciascun pozzetto, aggiungere 200 μl di anticorpo monoclonale (mAb-D1) diluito nel tampone carbonato.
nota: È stata determinata sperimentalmente una concentrazione ottimale di circa 1 μg/mL che corrisponde a una diluizione di circa 1/2000 del mAb-D1 purificato. Questa concentrazione consigliata è indicata per ogni lotto di mAb-D1 e deve essere verificata periodicamente con il controllo positivo.
- Coprire la piastra con una pellicola adesiva e incubare la micropiastra per 3 ore a 37 °C in atmosfera umidificata.
- Aspirare con cura e trasferire il contenuto del pozzetto in un recipiente contenente una soluzione di ipoclorito di sodio al 2,5%.
- Capovolgere la micropiastra e lasciarla asciugare su carta assorbente a temperatura ambiente per 5 min.
4. Passivazione delle micropiastre
- A ciascun pozzetto, aggiungere 300 μl di tampone di passivazione.
- Coprire la piastra con una pellicola adesiva e incubare per 30 minuti a 37 °C.
- Aspirare con cura e trasferire il contenuto del pozzetto in un recipiente contenente una soluzione di ipoclorito di sodio al 2,5%.
- Capovolgere la micropiastra e lasciarla asciugare su carta assorbente a temperatura ambiente per 1 min.
nota: La micropiastra può essere utilizzata immediatamente o conservata sigillata a -20 °C per un massimo di 3 mesi fino all'uso.
5. Saggio ELISA
NOTA: Per stabilire la curva di controllo del vaccino di riferimento, non è richiesto il passaggio 5.3; per titolare il vaccino testato sono necessari tutti i passaggi da 5.1 a 5.6.
- Lavaggio della micropiastra sensibilizzata
- A ciascun pozzetto, aggiungere 300 μl di tampone di lavaggio.
- Aspirare con cura e trasferire il contenuto del pozzetto in un recipiente contenente una soluzione di ipoclorito di sodio al 2,5%.
- Ripetere i passaggi 5.1.1 e 5.1.2 altre cinque volte per lavare abbondantemente la piastra sensibilizzata.
- Capovolgere la micropiastra e lasciarla asciugare su carta assorbente a temperatura ambiente per 1 min.
- Diluizioni del vaccino di riferimento per la curva di controllo
- Ricostituire il vaccino di riferimento (antigene di convalida lotto 09) in 1 mL di acqua distillata corrispondente a una concentrazione di 10 μg/mL di glicoproteina del virus della rabbia.
- Preparare una diluizione di dieci volte del vaccino di riferimento ricostituito nel diluente per raggiungere 1 μg/mL di glicoproteina del virus della rabbia.
- Preparare 6 diluizioni doppie seriali di questo vaccino di riferimento nel diluente come indicato nella Tabella 1.
- Distribuire 200 μl di diluente in duplicato (pozzetti 1H/2H) per fungere da controllo in bianco.
- Distribuire 200 μl per pozzetto di ciascuna diluizione del vaccino di riferimento in duplicato (pozzetti da G1/G2 a A1/A2).
- Diluizioni del vaccino testato per la sua titolazione
- Preparare una diluizione di dieci volte del vaccino testato nel diluente.
- Preparare 7 diluizioni seriali doppie del vaccino testato in diluente come indicato nella Tabella 2.
- Distribuire 200 μl per pozzetto di ciascuna diluizione del vaccino testata in duplicato (pozzetti da H3/H4 a A3/A4).
- Incubazione/Lavaggio della piastra ELISA
- Coprire la micropiastra con una pellicola adesiva e incubare per 1 ora a 37 °C.
- Rimuovere la pellicola, aspirare con cura e trasferire il contenuto di ciascun pozzetto in un recipiente contenente una soluzione di ipoclorito di sodio al 2,5%.
- A ciascun pozzetto, aggiungere 300 μL di tampone di lavaggio.
- Aspirare con cautela e trasferire il contenuto di ciascun pozzetto in un recipiente contenente una soluzione di ipoclorito di sodio al 2,5%.
- Ripetere i passaggi 5.4.3 e 5.4.4 cinque volte per rimuovere l'antigene non legato e conservare i trimeri della proteina G legati all'anticorpo rivestito (mAb D1).
- Capovolgere la micropiastra e lasciarla asciugare su carta assorbente a temperatura ambiente per 1 min.
- Legame del mAb-D1 coniugato con perossidasi
- Distribuire 200 μL per pozzetto della diluizione raccomandata (1/2000) di mAb-D1 marcato con perossidasi in diluente (concentrazione approssimativa di 1μg/mL). Per ogni lotto di mAb-D1 è indicata una concentrazione consigliata che deve essere verificata periodicamente con il controllo positivo.
- Coprire la micropiastra con una pellicola adesiva e incubare per 1 ora a 37 °C.
- Rimuovere la pellicola, aspirare con cura e trasferire il contenuto di ciascun pozzetto in un recipiente contenente una soluzione di ipoclorito di sodio al 2,5%.
- Aggiungere a ciascun pozzetto 300 μl del tampone di lavaggio.
- Aspirare con cautela e trasferire il contenuto di ciascun pozzetto in un recipiente contenente una soluzione di ipoclorito di sodio al 2,5%.
- Ripetere i passaggi 5.5.4 e 5.5.5 cinque volte per rimuovere l'anticorpo marcato con perossidasi non legato (mAb D1).
- Capovolgere la micropiastra e lasciarla asciugare su carta assorbente a temperatura ambiente per 1 min.
- Rivelazione utilizzando un cromogeno substrato
- Distribuire 200 μl per pozzetto di soluzione di substrato-cromogeno.
- Sigillare la micropiastra con una pellicola e incubare al buio a temperatura ambiente per 30 minuti. Si sviluppa un colore giallo-arancio, la cui intensità è proporzionale alla quantità di anticorpi marcati con perossidasi legata (mAb D1).
- Arrestare la reazione aggiungendo 50 μL di soluzione di arresto per pozzetto.
- Pulire accuratamente il fondo della micropiastra e posizionarla in uno spettrofotometro per determinare la densità ottica (OD) a 492 nm di tutti i pozzetti utilizzati: controllo negativo (bianco), vaccino di riferimento e vaccino testato.
- Raccogli i dati OD in formato .xls o .xlsx file per l'analisi.
Tabella 1. Tamponi utilizzati nel saggio.
| Tamponi e reagenti | preparazione |
Tampone di rivestimento
(Tampone carbonato 50mM pH=9,6) | Aggiungere il carbonato di sodio 50 mM (Na2CO 3-10H2O) al bicarbonato di sodio 50 mM (NaHCO3) fino al pH desiderato (circa 1/10 di volume di bicarbonato di sodio) |
| Tampone di passivazione | 0,3% albumina sierica bovina (BSA, frazione V), 5% saccarosio in tampone carbonato 50 mM pH 9,6 |
| 10x Soluzione salina tamponata con fosfato pH=7 (PBS 10x) | NaCl 80 g, KCl 2 g, Na2PO 4-12H2Ø 11,33 g, KH2PO4 2g in 1L di acqua distillata. Regolare pH=7 con 4N NaOH |
| Tampone di lavaggio | 0,05% di interpolazione in 1x PBS |
| diluente | 0,5% albumina sierica bovina (frazione V), 0,05% Tween in 1x PBS (regolare il pH a 7 a causa dell'acidificazione da BSA) |
Tampone citrato pH-5,6
(per substrato di perossidasi) | 11,67 g di citrato trisodico 2H2O (Na3C6H5O 7-2H20), 2,17 g di acido citrico-1H20 in 1L di acqua distillata |
| Soluzione substrato-cromogeno | 50 mg di compresse di ortofenilendiammina, 0,1% di perossido di idrogeno 30% (110 vol) in 25 ml di tampone citrato pH 5,6 |
Soluzione di arresto
(acido solforico 4N) | 10 ml di H2SO4 36N in 80 ml di acqua distillata raffreddata. La diluizione deve essere effettuata in un bagno di ghiaccio |