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Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Informazioni di base del gruppo di studio
NOTA: L'Allergy Information Repository dello State Key Laboratory of Respiratory Disease (AIR-SKLRD) è una grande banca del siero istituita all'interno del Guangzhou Institute of Respiratory Hospital (GIRH). Avviato nell'ultimo decennio, l'AIR-SKLRD ha già iniziato a raccogliere e conservare campioni di siero da pazienti con malattie allergiche e le loro informazioni cliniche (Tabella 1). Il presente studio è stato condotto con sieri dell'AIR-SKLRD.
- Cerca nel database dell'AIR-SKLRD i sieri raccolti da gennaio 2015 a giugno 2018 e seleziona i pazienti con malattia allergica che sono risultati sensibili agli allergeni comuni nella regione.
- Assicurarsi che tutti i pazienti selezionati abbiano malattie correlate alle allergie, come rinite allergica e/o asma, dermatite allergica e/o orticaria, e che il siero di questi pazienti contenga più sensibilizzazioni sieriche alle immunoglobuline E (sIgE) allergeni specifiche di allergeni comuni in questa regione, rilevate dal Sistema 1.
- Escludere i pazienti con cartelle cliniche incomplete, quelli persi al follow-up, quelli che rifiutano di dare il consenso informato in merito all'uso dei loro campioni di siero per scopi scientifici, quelli con un'immunodeficienza identificata, quelli attualmente in immunoterapia o agenti immunomodulatori o quelli che hanno avuto infezioni parassitarie.
- Assicurarsi che non sia stato somministrato alcun trattamento o prescrizione di farmaci prima della raccolta del siero per ridurre al minimo l'interferenza con i risultati di laboratorio. Tutti i campioni di siero che non soddisfacevano i criteri sono stati respinti.
2. Flusso di studio e misure di interesse
NOTA: Il sistema microfluidico ha bisogno di 100 μL di siero per determinare 19 allergeni. Il sangue venoso (5 mL) è stato raccolto da ciascun paziente utilizzando un vaso sanguigno sottovuoto contenente gel separatore. Dopo la centrifugazione per 10 minuti a 1.000 x g, lo strato superiore è stato raccolto per il test. Il siero non utilizzato è stato conservato a -80 °C. Prima del test, il siero è stato tenuto a temperatura ambiente per 30 minuti e agitato con un miscelatore a vortice. Sono stati evitati ripetuti cicli di congelamento e scongelamento.
- Testare principalmente i campioni di siero per le IgE e gli allergeni interi di Dermatophagoides pteronyssinus (d1), Dermatophagoides farinae (d2), Blomia tropicalis (d201), peli di gatto (e1), peli di cane (e5), erba delle Bermuda (g2), erba timoteo (g6), scarafaggi (i6), Aspergillus fumigatus (m3), Candida albicans(M5), ambrosia (W1), albume d'uovo (F1), latte (F2), grano (F4), arachidi (F13), soia (F14), mandorla (F20), granchio (F23) e gamberetti (F24). Segua le istruzioni fornite nel paragrafo 3.
NOTA: la determinazione delle IgE è stata effettuata con il kit per il dosaggio delle IgE allergene-specifiche (vedere la Tabella dei materiali) e misurata da un analizzatore a chemiluminescenza.
- Selezionare in modo casuale tre campioni tra i campioni con siero sufficiente (almeno 900 μL) per uno studio di riproducibilità. Mantenendo invariate tutte le condizioni, misurare i tre sieri per le IgE allergeniche ogni giorno per 9 giorni consecutivi (cioè 100 x 9 = 900 μL di siero).
3. Procedura di test semi-automazione del sistema microfluidico
NOTA: Il sistema 2 integra la tecnologia microfluidica automatica, il microarray di proteine, l'analisi della luce fredda, l'analisi parallela delle IgE e la tecnologia di elaborazione delle immagini. Il protocollo di test è diviso in quattro parti: preparazione dell'apparecchiatura, caricamento del campione, incubazione e misurazione.
- Preparazione dell'attrezzatura
- Accendere il PC e l'analizzatore power.
nota: L'interruttore di alimentazione si trova a sinistra della base.
- Avviare il programma LabIT sul PC. Se viene visualizzata la finestra di avviso Dark Frame, fare clic su OK per eseguire il test di tenuta. Successivamente, fare clic sul logo centrale per accedere all'interfaccia operativa.
nota: Il sistema ricorderà all'utente di eseguire il test di tenuta se inattivo per più di 24 ore.
- Controllare la temperatura di reazione e la temperatura CCD (dispositivo ad accoppiamento di carica) nell'angolo in basso a destra dello schermo. La temperatura di reazione dovrebbe salire a 37 °C ± 1 °C in circa 10 minuti e la temperatura CCD dovrebbe scendere a -15 °C ± 1 °C.
- Eseguire il test di tenuta dopo che la temperatura del CCD è scesa a -15 °C ± 1 °C. Prima di eseguire il test di TENUTA, assicurarsi che non siano rimasti altri oggetti all'interno dello strumento e chiudere lo sportello. Fare clic su Strumenti | Test di sistema | Test di tenuta. Non aprire la porta durante il test. Al termine del test, verrà visualizzata la finestra del rapporto.
- Caricamento del campione
- Aggiungere 620 μl di tampone di lavaggio, 120 μl di tampone bloccante, 60 μl di coniugati A e B, 60 μl di substrato A e B e 100 μl di campioni di siero al serbatoio dei reagenti corrispondente sulla cartuccia microfluidica.
- Incubazione
- Fare clic su ID cartuccia, utilizzare lo scanner di codici a barre per scansionare il numero di serie della cartuccia, inserire l'ID del campione, inserire la cartuccia nell'analizzatore, chiudere lo sportello e fare clic su Analizzatore ed esegui per avviare l'analisi.
- misurazione
- Esporta i risultati in un software statistico (ad es. Excel) dopo la misurazione.
NOTA: Dopo 30 minuti di incubazione, l'analizzatore esegue automaticamente la misurazione e riporta il risultato.
Tabella 1: Caratteristiche demografiche dei pazienti. In totale, sono stati trovati 293 soggetti che soddisfacevano i criteri di inclusione, con un'età media di 23 anni (intervallo interquartile da 8 a 36 anni). Tra questi, 170 (58,02%) erano maschi e 123 (41,98%) erano femmine. Inoltre, 92 (31,40%) di loro avevano rinite allergica, 117 (39,93%) avevano asma allergico, 36 (12,29%) avevano comorbilità di rinite e asma e 48 (16,38%) avevano altre malattie allergiche, come un'allergia alimentare o allergie cutanee.
| caratteristico | No.( % |
| Genere, n(%) | |
| femmina | 123(41.98%) |
| maschio | 170(58,02%) |
| Età, anno, n(%) | |
| Mediana (25%,75%) | 23(8,36) |
| ≤10 | 97(33.11%) |
| 11-20 | 37(12.63%) |
| 21-40 | 101 (34,47%) |
| >41 | 58(19.80%) |
| Diagnosi, n(%) | |
| Rinite allergica | 92(31.40%) |
| Asma allergico | 117(39,93%) |
| Rinite allergica con asma | 36(12.29%) |
| Altri | 48(16.38%) |