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1. Accoppiamento di nanoparticelle magnetiche (MNP)
- Utilizzare la procedura di accoppiamento commerciale e i reagenti per accoppiare gli MNP con gli anticorpi (Abs) (tipicamente 1 mg). Vengono utilizzate nanoparticelle di ossido di ferro con acido carbossilico come gruppi reattivi.
- Se gli anticorpi hanno un volume superiore a 0,5 ml, concentrare utilizzando un concentratore da 100K. Centrifugare a 2.000 x g per 3-5 min.
- Al termine della procedura, dopo aver aggiunto 10 μl di tampone di tempra, trasferire gli MNP in una provetta da 12 mm x 75 mm e aggiungere 3 ml di tampone di lavaggio/conservazione. Posizionare il tubo nel foro centrale di un separatore magnetico e lasciarlo riposare per una notte a 4 °C.
- Verificare che gli MNP si siano tutti raccolti sul lato della provetta, quindi pipettare con cura tutto il liquido. Aggiungere 3 ml di tampone di lavaggio/conservazione fresco e rimetterlo nel magnete.
- Dopo diverse ore, controllare se gli MNP sono raccolti sul lato della provetta e quindi pipettare il liquido. Utilizzare 2 ml di tampone di lavaggio/conservazione per risospendere gli MNP e conservare a 4 °C.
- Verificare che gli Ab siano accoppiati agli MNP etichettandoli con un frammento di anticorpo Fab fluorescente pertinente (ad es. anti-topo di capra se si utilizza un Ab monoclonale di topo per la cattura come descritto nella sezione 2) ed eseguire l'analisi su un citometro a flusso.
2. Marcatura degli anticorpi accoppiati agli MNP
- Combinare 60 μl (3,9 x 1012 particelle) di MNP (per condizione) e 5 μl (di una soluzione commerciale da 200 μg/ml) di frammenti Fab marcati, specifici per l'isotipo dell'Ab di cattura, in una provetta per microcentrifuga da 1,5 ml.
- Incubare a temperatura ambiente (RT) per 30 minuti con miscelazione continua.
- Pre-bagnare un concentratore da 100K con 300 μl di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e centrifugare in una microcentrifuga a 1.500 x g per 5 minuti.
- Purificare i complessi marcati su colonna da 100K. Centrifugare la miscela dal passaggio 2.2 in una microcentrifuga a 1.500 x g per 5 minuti, lavare con 200 μl di PBS e recuperare nel volume iniziale.
3. Uso di complessi Ab-MNP marcati per catturare particelle di interesse (vescicole extracellulari, EV)
- Incubare MNP pre-marcati 60 μl (3,9 x 1012 particelle) con preparazione EV (100 μl).
- Prepara i preparativi per le vescicole extracellulari utilizzando vari metodi. Qui, purificare le vescicole extracellulari su gradienti di saccarosio, raccoglierle dal plasma povero di piastrine utilizzando reagenti di precipitazione degli esosomi o isolarle direttamente dal plasma.
nota: I rapporti ottimali devono essere determinati per ogni esperimento e dipendono dalla concentrazione di EV nella preparazione. La frazione MNP-Ab dovrebbe essere ~106 in eccesso rispetto alla concentrazione della frazione EV.
- Incubare 1 ora a 4 °C per le vescicole extracellulari.
- Aggiungere il 2,5% di IgG di topo/IgG umane per bloccare il legame Fc, vorticare delicatamente, incubare 3-5 minuti a RT.
- Aggiungere le concentrazioni consigliate dal produttore o titolate di ciascun Abs di rilevamento e incubare altri 20 minuti a RT.
4. Separazione delle vescicole extracellulari catturate da MNP da anticorpi non legati utilizzando colonne magnetiche
- Preparare la colonna di separazione magnetica per l'uso posizionandola in un magnete separatore.
- Pre-bagnare la colonna con 500 μl di tampone di lavaggio (2 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 0,5% di albumina sierica bovina (BSA) in PBS). Lasciare che il tampone di lavaggio scorra attraverso la colonna.
- Aggiungere i complessi MNP-EV alla colonna e lasciare fluire tutto il liquido. Aggiungere 500 μl di tampone di lavaggio alla colonna, consentendo il passaggio dell'intero volume.
- Ripetere il lavaggio con il tampone di lavaggio altre 2 volte.
- Rimuovere la colonna dal magnete e posizionarla in un tubo da 12 mm x 75 mm per la raccolta dei complessi MNP-EV trattenuti. Lasciare riposare la colonna nel tubo fuori dal magnete per 3 minuti. Aggiungere 200 μl di PBS e lasciare che le perle scorrano verso il basso per gravità, aggiungere altri 200 μl di PBS e fissare con 200 μl di paraformaldeide al 4% dopo l'eluizione.
nota: La paraformaldeide è un sospetto cancerogeno e deve essere maneggiata in un cappuccio ventilato e devono essere indossati guanti.
- Per quantificare le singole EV, utilizzare le impostazioni volumetriche del campionatore ad alta produttività (HTS) o, appena prima dell'acquisizione, aggiungere microsfere di conteggio della citometria a flusso ben miscelate.
5. Analisi delle vescicole extracellulari catturate da MNP con un citometro a flusso
- Riscaldare il citometro a flusso per 30 minuti.
- Esegui le perline di controllo qualità.
- Impostare la soglia sulla fluorescenza di MNP o EV marcate. Utilizzare PBS filtrato da 0,22 μm per la soglia per ridurre il "rumore" di fondo. Impostare la soglia regolando la tensione PMT al livello in cui il PBS filtrato non fornisce alcun evento o ne restituisce pochissimi.
- Esegui gli esempi a bassa temperatura. (Utilizzare un filtro in linea aggiuntivo da 0,04 μm per il fluido della guaina posizionato in serie dietro il filtro della guaina standard da 0,2 μm per eliminare ulteriormente i falsi eventi).