$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Preparazione del campione biologico
NOTA: Il sito anatomico scelto e il volume di raccolta del sangue sono lasciati alla discrezione di ogni singolo ricercatore e non influenzeranno l'esito del test. Tuttavia, una volta ottenuti, i campioni devono essere maneggiati secondo i passaggi elencati di seguito.
- Preparazione di campioni di siero
- Raccogliere il volume di sangue desiderato nella provetta di raccolta preferita e lasciarla coagulare per almeno 30 minuti.
- Centrifugare il campione per 10 minuti a 1.000 x g a temperatura ambiente.
- Rimuovere immediatamente il siero e il test o aliquotare in provette per microcentrifuga in polipropilene e conservare i campioni a ≤ -20 °C.
- Preparazione di campioni di plasma
- Raccogliere il volume di sangue desiderato utilizzando provette per la raccolta del sangue rivestite di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA).
- Centrifugare per 10 minuti a 1.000 x g a temperatura ambiente entro 30 minuti dalla raccolta.
- Rimuovere immediatamente il plasma e il dosaggio, oppure aliquotare in provette per microcentrifuga in polipropilene e conservare i campioni a ≤ -20 °C.
- Preparazione di campioni di surnatante per colture tissutali
- Centrifugare il campione per 10 minuti a 1.500 x g a 4 °C per rimuovere cellule e detriti.
- Raccogliere immediatamente il surnatante e il saggio o aliquotare in provette per microcentrifuga in polipropilene e conservare a ≤ -20 °C.
- Scongelamento di campioni biologici congelati
- Scongelare completamente tutti i campioni biologici precedentemente congelati su ghiaccio e vortice brevemente prima dell'uso. Evitare più di 2 cicli di congelamento/scongelamento.
nota: I campioni utilizzati in questo protocollo sono stati ottenuti coltivando splenociti di topo BALB/c (1 x 106 cellule a 37 °C + 5% CO2 in varie condizioni: non stimolato, LPS (100 ng/mL), αCD3 (1 μg/mL rivestito su piastra) + αCD28 (1 μg/mL solubile), PMA (20 ng/mL) + Ionomicina (500 ng/mL). I surnatanti di coltura sono stati raccolti dopo 48 ore e trattati come descritto nel paragrafo 1.3.
2. Preparazione dei reagenti
- Preparazione di perle premiscelate anticorpo-immobilizzate
- Sonicare il flacone di perle premiscelate per 1 minuto in un bagno di sonicazione a temperatura ambiente, quindi vorticare per 30 s prima dell'uso. Se non è disponibile alcun bagno di sonicazione, aumentare il tempo di vortice a 1 minuto.
- Preparazione del tampone di lavaggio
- Portare il tampone di lavaggio 20x (20x PBS con 1% Tween-20) fornito con il kit a temperatura ambiente e vorticare per portare tutti i sali nella soluzione.
- Diluire 25 mL di 20x Wash Buffer con 475 mL di acqua deionizzata. Conservare le porzioni inutilizzate tra 2 °C e 8 °C per un massimo di un mese.
- Preparazione della matrice B (da utilizzare solo con campioni di siero e plasma)
- Aggiungere 5,0 mL di tampone per il saggio (PBS con l'1% di BSA) incluso nel kit al flacone contenente la matrice B liofilizzata. Attendere almeno 15 minuti per la completa ricostituzione, quindi frullare bene a vortice. La matrice B ricostituita rimanente può essere conservata a ≤ -70 °C per un massimo di un mese.
3. Preparazione standard
NOTA: Ogni analita in questo pannello ha una concentrazione standard massima di 10.000 pg/mL.
- Aggiungere 250 μl di tampone per il saggio per ricostituire il cocktail standard di citochine Th di topo liofilizzato. Mescolare mescolando brevemente e lasciare riposare la fiala a temperatura ambiente per 10 minuti.
- Trasferire il cocktail standard in una provetta da microcentrifuga in polipropilene etichettata "C7". Questo sarà utilizzato come standard superiore.
- Etichettare 6 provette per microcentrifuga in polipropilene come C6, C5, C4, C3, C2 e C1.
- Aggiungere 75 μl di tampone per saggi a ciascuna di queste provette.
- Trasferire 25 μl del C7 standard superiore nella provetta C6 e mescolare bene mediante vortex. Questo sarà lo standard C6.
- Continuare a eseguire diluizioni seriali 1:4 utilizzando un nuovo puntale per pipetta per ciascuna provetta per aggiungere 25 μl dello standard precedente ai 75 μl di tampone per saggio nella provetta standard più bassa successiva, seguita dal vortice per ottenere gli standard C5, C4, C3, C2 e C1. Utilizzare il tampone di analisi come standard 0 pg/mL (C0).
4. Diluizione del campione
NOTA: Potrebbero essere necessari esperimenti pilota preliminari che utilizzano questo test con diluizioni multiple per determinare il fattore di diluizione più appropriato per un particolare set di campioni biologici. Un fattore di diluizione appropriato produrrà calcoli di concentrazione per il campione che si trovano entro i limiti della curva standard. I passaggi seguenti sono intesi come linee guida e potrebbero dover essere determinati empiricamente a seconda del tipo di campione.
- Diluire i campioni di siero o plasma 2 volte con il tampone di analisi (ad es. diluire 50 μl di campione con 50 μl di tampone di saggio) in provette da microcentrifuga in polipropilene.
nota: Se è necessaria un'ulteriore diluizione del campione, le diluizioni devono essere eseguite con la matrice B anziché con il tampone di analisi per garantire una misurazione accurata. L'aggiunta di campioni di siero o plasma senza diluizione comporterà una bassa accuratezza del test e potrebbe ostruire la piastra filtrante. La matrice B è costituita da siero di topo aggregato impoverito di bersagli di test endogeni. Viene utilizzato come diluente per campioni di siero o plasma per evitare gli effetti matrice, che sono noti per influenzare la sensibilità analitica dei dosaggi immunologici.
- Campioni di surnatante per colture cellulari di prova senza diluizione.
nota: I livelli di analita possono variare notevolmente da campione a campione. Se necessario, diluire i campioni di surnatante utilizzando una nuova preparazione del terreno di coltura cellulare corrispondente o del tampone di saggio.
5. Procedura di analisi
NOTA: Il test può essere eseguito in piastre filtranti in polipropilene, provette di selezione cellulare attivate da microfluorescenza (FACS) o micropiastre con fondo a V. La procedura di analisi su piastra filtrante è consigliata per la buona consistenza da campione a campione, la robustezza del test e la facilità di manipolazione. Questa procedura richiede un'unità di filtrazione sottovuoto per il lavaggio (fornita dall'utente finale).
- Lasciare che tutti i reagenti si riscaldino a temperatura ambiente (20 - 25 °C) prima dell'uso.
- Posizionare sempre la piastra filtrante su un coperchio della piastra capovolto durante le fasi di configurazione e incubazione del saggio, in modo che il fondo della piastra non tocchi alcuna superficie, poiché potrebbe causare perdite.
- Tenere la piastra in posizione verticale durante l'intera procedura di analisi, comprese le fasi di lavaggio, per evitare di perdere le perle.
- Tenere la piastra al buio o avvolta con un foglio di alluminio per tutte le fasi di incubazione.
- Eseguire tutti gli standard e i campioni come duplicati disposti sulla lastra in ordine sequenziale.
- Pre-bagnare la piastra filtrante aggiungendo 100 μL di 1x Wash Buffer a ciascun pozzetto e lasciarla riposare per 1 minuto a temperatura ambiente (se si utilizza la micropiastra sul fondo del filtro).
- Rimuovere il volume del tampone utilizzando il collettore del vuoto (5 - 10 s). Non superare i 10" Hg di vuoto. Tamponare il tampone di lavaggio in eccesso dal fondo della piastra premendo la piastra su una pila di carta assorbente pulita. Posizionare la piastra sopra il coperchio della piastra rovesciata.
nota: I passaggi 5.1 - 5.2 possono essere omessi se il test viene eseguito utilizzando una micropiastra con fondo a V o microprovette FACS.
- Per i campioni di surnatante per colture cellulari, aggiungere 25 μl di tampone per saggi a tutti i pozzetti. Aggiungere 25 μl di ogni standard ai pozzetti standard. Aggiungere 25 μl di ciascun campione ai pozzetti del campione.
- Per misurare campioni di siero o plasma, aggiungere 25 μl di matrice B ai pozzetti standard. Aggiungere 25 μl di tampone del saggio ai pozzetti del campione. Aggiungere 25 μl di ogni standard ai pozzetti standard. Aggiungere 25 μl di ciascun campione di siero o plasma diluito ai pozzetti del campione.
- Agitare le perle miscelate per 30 s. Aggiungere 25 μL di perle miscelate in ciascun pozzetto, agitando il flacone di perle a intermittenza per evitare che le perle si depositino. Il volume finale dovrebbe essere di 75 μl in ciascun pozzetto dopo l'aggiunta delle perle.
- Sigillare la piastra con un sigillante per piastre. Avvolgere l'intera piastra, compreso il coperchio della piastra rovesciata, con un foglio di alluminio. Posizionare la piastra su uno shaker, fissarla e agitare a circa 500 giri/min per 2 ore a temperatura ambiente. Per evitare perdite, non applicare una pressione positiva alla sigillante per piastre.
- Senza capovolgere, posizionare la piastra sul collettore del vuoto, applicare il vuoto come prima e aggiungere 200 μl di tampone di lavaggio 1x a ciascun pozzetto.
- Rimuovere il contenuto dei pozzetti della piastra di saggio mediante filtrazione sotto vuoto. Tamponare il tampone di lavaggio in eccesso dal fondo della piastra con un tampone assorbente o della carta assorbente. Ripetere questo passaggio ancora una volta.
nota: Se il test viene eseguito utilizzando una micropiastra con fondo a V o provette micro FACS, saltare i passaggi 1.12 e 1.13. Centrifugare invece la piastra a 1.000 x g per 5 minuti a temperatura ambiente, quindi rimuovere il surnatante utilizzando una pipetta multicanale.
- Aggiungere 25 μl di anticorpi di rilevazione (vedere la Tabella dei materiali) a ciascun pozzetto.
- Sigillare la piastra con un nuovo sigillante per piastre. Avvolgere l'intera piastra, compreso il coperchio della piastra rovesciata, con un foglio di alluminio.
- Posizionare la piastra su uno shaker per piastre e agitare a circa 500 giri/min per 1 ora a temperatura ambiente.
- Senza passare l'aspirapolvere, aggiungere 25 μL di reagente streptavidina-ficoeritrina (SA-PE) direttamente in ciascun pozzetto. Non è necessaria alcuna diluizione del reagente.
- Sigillare la piastra con un nuovo sigillante per piastre. Avvolgere l'intera piastra, compreso il coperchio della piastra rovesciata, con un foglio di alluminio.
- Posizionare la piastra su uno shaker e agitare a circa 500 giri/min per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Ripetere il passaggio 1.13 sopra.
- Aggiungere 200 μl di 1x tampone di lavaggio a ciascun pozzetto. Rimettere in sospensione le perline su uno shaker per 1 minuto.
- Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire i campioni dalla piastra filtrante alle provette FACS per leggere i campioni su un citometro a flusso.
nota: Il volume del campione può essere aumentato da 200 μl a 300 μl aggiungendo altri 100 μl di 1x tampone di lavaggio a ciascuna provetta per evitare che il campione si asciughi. Se necessario, i campioni possono essere conservati a 4 °C, al riparo dalla luce e analizzati il giorno successivo. Tuttavia, la conservazione prolungata del campione può portare a una riduzione del segnale.