Analisi basata sulla citometria a flusso dell'attivazione delle cellule dendritiche mediante immunocomplessi

Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.

1. Isolamento di cellule dendritiche derivate da monociti associati al tumore

1. In una cappa a flusso laminare, rimuovere i tumori dai topi eutanasia con CO₂ e posizionare i tumori in terreno RPMI senza siero fetale bovino (FBS).
   nota: Si consiglia vivamente di radere i topi e spruzzarli con etanolo al 70% prima di rimuovere i tumori per ridurre al minimo le potenziali contaminazioni dalla pelliccia. Assicurati che il tumore non superi i 25 - 40 mm² poiché i tumori più grandi hanno meno cellule dendritiche (DC) che tendono ad essere fragili e inclini a subire la morte cellulare. Se è necessario un numero maggiore di DC, ogni topo può essere iniettato con cellule tumorali in più siti.
2. Sotto una cappa laminare sterile, tagliare i tumori in piccoli pezzi (circa 1 x 1 mm²) utilizzando le forbici chirurgiche.
   1. Aggiungere tutti i frammenti tumorali di un topo in una provetta sterile a fondo piatto da 30 ml con ancorette magnetiche contenente 5 ml di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS), 2 mg/mL di collagenasi IV e 0,01 mg/mL di DNasi I.
      cautela: Le cellule mieloidi producono energia attraverso la glicosilazione, anche in uno stato stazionario. Pertanto, utilizzare solo terreni che contengono glucosio (ad esempio, HBSS, Roswell Park Memorial Institute (RPMI) e Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)), poiché la carenza di glucosio per soli 10-15 minuti provocherà la morte cellulare e l'apoptosi entro 24 ore. Utilizzare solo una collagenasi EV a basso contenuto di endotossina, poiché la collagenasi è prodotta da batteri Gram-positivi (Clostridium histolyticum).
3. Mescolare a circa 200 - 400 giri/min in un'incubatrice da 37 ^oC con agitatore magnetico per 20-30 minuti.
4. Aggiungere 5 mL di terreno completo e risospendere energicamente.
5. Filtrare le celle attraverso un filtro cellulare da 70 μm. Centrifugare a 4 ^oC 400 rcf per 5 - 10 min per pellettare le cellule.
   cautela: Non tentare di isolare le cellule subito dopo la digestione enzimatica, poiché alcuni tumori sono necrotici e contengono quantità relativamente grandi di detriti cellulari o matrice extracellulare. Applicare le celle su un mezzo di gradiente di densità del 15% per ottenere solo le celle.
6. Sospendere 9 mL di terreno a gradiente di densità con 1 mL di soluzione salina tamponata con fosfato 10x (PBS) per regolare l'osmolalità e ottenere una soluzione madre di Percoll al 100%. Miscelare 1,5 mL di soluzione madre a gradiente di densità con 8,5 mL di HBSS e miscelarla energicamente con pellet cellulare derivato dal tumore. Sovrapporre delicatamente 2 mL di DMEM su un terreno con gradiente di densità del 15% e centrifugare a 400 rcf per 20 minuti a temperatura ambiente. Scartare i surnatanti, poiché le cellule formeranno un pellet sul fondo del tubo.
   1. Lavare le cellule pellettate due volte rimettendole in 10 mL di HBSS contenente il 2% di FBS, l'1% di penicillina/streptomicina e 10 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) (tampone di isolamento) e centrifugare a 4 ^oC 400 rcf per 5-10 minuti per pellettare le cellule.
   2. Contare le cellule su un emocitometro utilizzando il blu di tripano al microscopio ottico.
7. Risospendere 1 x 10⁸ cellule in un tampone di isolamento da 1 mL e incubarle a 4 ^oC con 30 μL di biglie magnetiche coniugate CD11b⁺ per 15 minuti
   ATTENZIONE: Evitare l'uso di perle coniugate con CD11c, poiché ciò attiverà la DC e indurrà la morte cellulare. Non tentare di bloccare FcγRII e FcγRIII con anticorpi anti-CD16/32. Gli anticorpi bloccanti legano FcγR, inducono una forte fosforilazione delle chinasi della proteina attivata dal mitogeno (MAP) e innescano la DC.
   1. Rimuovere le perle non legate in eccesso aggiungendo 9 mL di tampone di isolamento e centrifugare le celle a 400 rcf per 5 - 10 minuti a 4^oC.
8. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in un tampone di isolamento da 1 mL. Applicare le celle su una colonna magnetica prelavata. Lavare la colonna due volte con 3 mL di tampone di isolamento.
   1. Rimuovere la colonna dal magnete. Pipettare 6 mL di tampone di isolamento sulla colonna e sciacquare le cellule marcate magneticamente in una provetta di raccolta sterile spingendo lo stantuffo. Centrifugare le celle a 400 rcf per 5 - 10 min a 4 ^oC.
   2. Risospendere le cellule a 100 μL per 1 x 10⁷ cellule e colorare con i seguenti anticorpi fluoroforo-coniugati: Linage negativo (TCRb, Siglec F, B220, CD19, FceRI e Ly6G), MHCII, Ly-6C.
9. Ordinare le cellule mediante gating delle piccole cellule, utilizzando la dispersione laterale (SSC) e la diffusione diretta (FSC) e la coltura in un terreno completo integrato con 5 ng/mL GM-CSF - Incubare le cellule per 1 ora a 37 ^oC per consentire ai macrofagi di aderire alla piastra. Quindi, trasferire le cellule sciolte e non aderenti in un nuovo piatto di coltura.
   nota: I MoDC di topo sono definiti come CD11b⁺/CD11c⁺/MHCII^hi/Ly6C^lo/int. L'espressione di Ly6C può variare notevolmente tra i modelli tumorali e, in alcuni modelli (ad esempio, LMP), i MoDC mancano completamente di espressione di Ly6C. Un tumore³ B16F10 di 100 mm contiene tipicamente 5 x 10⁴ di DC, risultando in circa 4 - 5 x 10⁶ cellule totali. Di queste cellule, il 10-15% sono cellule immunitarie e l'8-10% sono MoDC. L'aumento del numero di DC può essere ottenuto iniettando nei topi tumori in più siti. Smistare solo piccole cellule SSC/FCS, poiché altre cellule mieloidi possono esprimere marcatori come CD11c e Ly6C.
   opzionale: Smistare i monociti infiltranti il tumore come piccole cellule SSC/FSC che esprimono Ly6C^hi e sono negative per MHCII. Successivamente, coltivare monociti in vitro con 50 ng/mL GM-CSF per ottenere DC.

2. Preparazione dei complessi immunitari Tumore-IgG

1. Coltura di cellule tumorali in un pallone di coltura da 75 cm² alla confluenza al 70% in terreno DMEM completo.
   1. Aggiungere 2 mL di tripsina/EDTA allo 0,25% per staccare le cellule dal pallone di coltura e monitorare la morfologia cellulare al microscopio ottico per evitare un'eccessiva tripsinizzazione.
   2. Aggiungere 8 mL di terreno di coltura completo (per 2 mL di tripsina) per inibire la digestione della tripsina e centrifugare a 4 ^oC, 400 rcf per 5-10 minuti per pellettare le cellule.
      nota: Controllare le cellule tumorali per il micoplasma utilizzando un kit PCR commerciale. Test per batteri Gram-negativi ed endotossine fungine utilizzando il saggio Limulus Amebocyte Lysate (LAL)). Il siero deve essere filtrato attraverso 0,22 μM e testato per i 9 virus del Code of Federal Regulations. Inoltre, testare i terreni di coltura e i sieri facendo cadere 100 - 200 μL su agar LB o brodo e coltivare per 2 giorni a 37 ^oC.
   3. Lavare nuovamente le cellule dalla tripsina e dai residui di siero risospendendole in 10 mL di PBS e centrifugare a 400 rcf per 5 - 10 minuti. Aspirare il surnatante e ripetere il lavaggio altre 2 volte.
2. Fissare le cellule in paraformaldeide tamponata all'1,8% per 10 minuti a temperatura ambiente.
   1. Lavare le cellule risospendendole in 10 mL di PBS e centrifugare a 4 ^oC 400 rcf per 5 - 10 min.
   2. Aspirare i surnatanti e ripetere il lavaggio altre due volte.
      opzionale: Per i saggi di captazione tumorale, le cellule possono essere marcate incubandole per 5 minuti a 37 ^oC in PBS contenente 1 μM di carbossifluoresceina succinimidil estere (CFSE). Il CFSE viene quindi raffreddato con un terreno completo per 10 minuti in ghiaccio. Le cellule devono essere lavate abbondantemente in PBS contenente il 2% di siero per rimuovere il colorante residuo.
3. Risospendere le cellule in tampone di selezione cellulare attivato da fluorescenza (FACS) (PBS integrato con FCS al 2% + 5 mM EDTA) e 0,5 μg/mL di anti-CD16/32 per bloccare potenziali interazioni proteina-proteina non specifiche. Piastra a forma di U 96 pozzetti/piastra a una concentrazione di 1 x 10⁵ celle per 100 μL.
   1. Aggiungere diverse diluizioni di anticorpi leganti il tumore che vanno da 5 μg a 5 ng/1 x 10⁵ cellule. Incubare la piastra su ghiaccio per 15-20 min.
      nota: Gli anticorpi IgG sono stati isolati dal siero di topi femmine naïve di 20-24 settimane su colonne di proteina A, come descritto.
4. Lavare le celle aggiungendo 150 μL di PBS e centrifugare la piastra a 4 ^oC 400 rcf per 5 - 10 min.
   1. Scartare i surnatanti e ripetere il lavaggio due volte. Risospendere le cellule in tampone FACS da 100 μL contenente anticorpo secondario coniugato con fluoroforo. Incubare la piastra su ghiaccio per 20 min.
   2. Lavare le celle aggiungendo 200 μl di tampone FACS e centrifugare la piastra a 400 rcf per 5 - 10 minuti. Scartare i surnatanti e ripetere il lavaggio.
   3. Analizza il legame tumorale mediante citometria a flusso e determina la concentrazione minima richiesta per rivestire le cellule.
      nota: Gli anticorpi che non aumentano l'intensità media di fluorescenza (MFI) delle cellule tumorali colorate di almeno cinque volte rispetto al controllo dell'isotipo non devono essere utilizzati nei successivi saggi funzionali.

3. Attivazione di MoDC con IC Tumor-IgG

1. Rivestire le cellule tumorali con concentrazione minima di IgG, come descritto nei paragrafi da 2.1 a 2.4.3
   1. Un giorno prima di attivare il MoDC con l'IC tumorale, sostituire il terreno di coltura MoDC contenente GM-CSF. A tal fine, aspirare delicatamente il terreno e lavare le cellule una volta con terreno di coltura completo preriscaldato.
      nota: Le MoDC isolate associate a tumore maturo devono essere coltivate per almeno 2 - 3 ore (o anche durante la notte) dopo la selezione in terreno completo senza GM-CSF e prima di attivarle con IC.
   2. Per le analisi della captazione tumorale, aggiungere l'IC tumorale marcato con CFSE al MoDC con un rapporto di 1:5 (IC: MoDC) e incubare durante la notte per 12 - 16 ore in 1 mL di terreno completo per 1 x 10⁶ DC.
   3. Per le analisi FACS degli esperimenti di attivazione di MoDC, aggiungere tumor-IC con un rapporto 1:1 (IC: MoDC) e incubare durante la notte per 12 - 16 h.
      nota: Si raccomanda vivamente di includere un pozzetto di controllo positivo, in cui i MoDC vengono stimolati con 1 μg/mL di LPS o altri agonisti TLR.
   4. Dopo l'attivazione notturna, aspirare i surnatanti e lavare delicatamente le cellule tre volte con tampone di isolamento o 10 mM EDTA HBSS.
   5. Per staccare la DC dalla piastra, incubare le cellule per 2 - 3 minuti in 1 mL di HBSS contenente 10 mM di EDTA e staccare le cellule mediante pipettaggio vigoroso.
   6. Centrifugare le celle a 400 rcf e risospendere 1 x 10⁶ DC in 90 μL di PBS integrato con FCS al 2%, 5 mM EDTA (tampone FACS) e 0,5 μg di anticorpi bloccanti. Incubare con ghiaccio per 5 - 10 minuti.
   7. Aggiungere 10 μl di miscela di anticorpi coloranti alle cellule e incubare su ghiaccio per 15 minuti.
   8. Aggiungere 2 mL di tampone FACS alle cellule e centrifugare a 4 ^oC 400 rcf per 5 - 10 minuti.
2. Risospendere le cellule in tampone FACS da 200 μL.
   1. Aggiungere 0,5 - 1 μg/mL di DAPI 1 - 2 minuti prima di analizzare i campioni per escludere le cellule morte dalle analisi. Non incubare eccessivamente il DAPI, poiché il MoDC lo assorbirà entro 10 - 15 minuti.