1. Sezionamento dei tessuti e preparazione dei vetrini
- Tagliare sezioni di tessuti fissati in formalina e inclusi in paraffina (FFPE) a uno spessore di 3-5 μm utilizzando un microtomo.
- Far galleggiare le sezioni su acqua purificata con una temperatura di circa 10 °C inferiore al punto di fusione della paraffina utilizzata. Sollevare le sezioni dall'acqua su vetrini da microscopio appositamente trattati (vedi Tabella dei materiali). Lasciare che l'acqua scarichi completamente dagli scivoli.
- Incubare i vetrini per una notte a 50 °C per migliorare l'adesione dei vetrini dei tessuti.
nota: È preferibile preparare tessuti appena sezionati per i protocolli IHC, sebbene le sezioni di controllo positivo e negativo TSE possano essere preparate in anticipo e conservate. I passaggi da 2 a 4 devono essere eseguiti in una cappa chimica.
2. Deparaffinazione e reidratazione
- Posizionare i vetrini con le sezioni di tessuto in un cestello di colorazione in acciaio inossidabile (vedere la tabella dei materiali). Immergere il cestello in un bagno di xilene (contenitore per la colorazione in acciaio inossidabile) per 3 minuti, rimuoverlo e immergerlo nuovamente.
- Rimuovere lo xilene e reidratare le sezioni immergendole in un bagno di etanolo assoluto per 3 minuti. Rimuovere e immergere nuovamente.
- Asciugare le sezioni all'aria e metterle in un bagno di etanolo al 90% per 1 minuto. Trasferire in un bagno di etanolo al 70% per un altro minuto, seguito da un trasferimento finale in un bagno di etanolo al 50% per 1 minuto. Per ogni trattamento con bagno di etanolo, agitare delicatamente due volte il cestello del vetrino e svuotare il cestello prima del trasferimento successivo.
3. Recupero dell'epitopo
- Immergere con cura le sezioni di tessuto in acido formico al 98% a temperatura ambiente per 30 minuti. Sciacquare le sezioni in acqua di rubinetto per 5 minuti, quindi risciacquare due volte in acqua distillata.
cautela: L'acido formico è altamente corrosivo. È necessario indossare occhiali e guanti protettivi.
- Eseguire il recupero dell'antigene indotto dal calore (HIER) seguendo i passaggi seguenti.
nota: Questa fase viene eseguita mediante autoclave idrata a 121 °C per 30 minuti in un'apposita camera a pressione (vedi Tabella dei Materiali).
- Preriscaldare il tampone citrato (10 mM, pH 6,1, vedere la tabella dei materiali) a 98 °C per circa 20 minuti in un contenitore colorante in acciaio inossidabile posto all'interno della camera a pressione riempita con 500 ml di acqua distillata.
nota: Per il presente studio, il set point del programma era 1 (SP1) per l'apparecchiatura specifica utilizzata.
- Dopo che l'allarme indica che l'apparecchiatura ha raggiunto il tempo e la temperatura programmati, immergere il cestello con le slitte e avviare il programma al Set Point 2 (121° C per 30 min). Ai fini del controllo di qualità, posizionare una sezione di nastro adesivo indicatore per autoclave sul cestello per monitorare la temperatura e la pressione e registrare la pressione iniziale e finale di questo programma.
- Se il numero di vetrini da immunocolorare non raggiunge la capacità del cestello, utilizzare vetrini puliti e vuoti per occupare le posizioni vuote. Al termine del programma, consentire il ritorno passivo della camera alla pressione ambiente (almeno 30 min).
nota: Una durata più lunga può ridurre la colorazione di fondo non specifica.
- Trasferire con cautela il cestello del vetrino in un contenitore di colorazione in acciaio inossidabile riempito con acqua distillata per 5 minuti.
4. Inattivazione della perossidasi endogena
- Immergere il cestello per vetrini contenente le sezioni del campione in un bagno di perossido di idrogeno al 3% (H2O2) in metanolo per 30 minuti. Sciacquare le sezioni sotto l'acqua corrente (5 minuti). Scolare e immergere le sezioni in 1 soluzione salina tamponata con Tris (TBS) per altri 5 minuti.
5. Immunorilevamento
NOTA: Per il presente studio, l'immunorilevamento è stato eseguito utilizzando il formato del gap capillare utilizzando un sistema di assemblaggio di clip per vetrini disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali). Sono applicabili anche altri sistemi di vetrini per immunoistochimica.
- Posizionare ogni vetrino su un supporto per piastra di copertura disponibile in commercio (vedere la Tabella dei materiali) pre-inumidito con TBS, evitando bolle, con il lato in tessuto rivolto verso il supporto e i bordi del vetrino coincidenti con i due punti inferiori del supporto.
- Tenere il gruppo portavetrini tra il pollice e l'indice, con un dito sopra il vetrino campione e l'altro sulla parte inferiore del supporto. Quindi, posizionate l'assieme nella galleria del sistema.
- Per assicurarsi che il set sia ben assemblato, riempire il pozzetto tra il vetrino del campione e il supporto con TBS, che non deve traboccare immediatamente. Da questo punto in poi, assicurarsi che circa 80 μl di TBS debbano essere trattenuti tra il supporto e il vetrino. Non lasciare asciugare le ciocche.
- Una volta nel sistema, per ridurre la colorazione di fondo prima del trattamento con anticorpi primari (anticorpi contro le proteine prioniche (anti-PrP), vedere la Tabella dei materiali), pre-incubare i vetrini del campione con il 20% di siero normale della stessa specie dell'ospite dell'anticorpo secondario utilizzato per l'immunocolorazione (in questo caso, siero di cavallo) per 30 minuti in TBS.
- Scongelare il numero di aliquote di anticorpi da utilizzare in base alla specie animale da analizzare, il numero di sezioni di campione da esaminare e la quantità di diluizione di lavoro.
nota: Per ottenere i migliori risultati, utilizzare il 10% di siero normale della stessa specie come fonte dell'anticorpo secondario e delle soluzioni di anticorpi primari. Se possibile, per ottenere i migliori risultati, la fonte ospite del siero normale e dell'anticorpo secondario dovrebbe provenire dalla stessa specie.
- Senza lavare le sezioni, applicare la soluzione di anticorpi primari direttamente (200 μL) in ciascun pozzetto del set di portavetrini e incubare per 60 minuti a temperatura ambiente.
- Per il lavaggio, riempire i pozzetti dei set portavetrini con TBS e attendere 5 minuti. Ripetere due volte.
- Diluire l'anticorpo secondario biotinilato (monoclonale anti-murino Horse Ab, vedere la Tabella dei materiali) a 1/200 in TBS con il 10% di siero di cavallo. Preparare il volume necessario in base al numero di sezioni da trattare.
- Applicare la soluzione di anticorpi secondari (200 μL) in ciascun pozzetto del set di supporto per vetrini. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Lavare come descritto al punto 5.5.
- Per l'incubazione con il complesso avidina-biotina perossidasi (complesso ABC/HRP, vedere la Tabella dei materiali), preparare il reagente 30 minuti prima dell'uso. Applicare la soluzione complessa ABC/HRP (200 μL) in ciascun pozzetto del set di supporto della piastra di scorrimento. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Lavare come descritto al punto 5.5.
6. Sviluppo con cromogeno 3,3' diaminobenzidina (DAB)
ATTENZIONE: Il DAB è un potenziale cancerogeno. Di conseguenza, è necessaria un'attenzione adeguata mentre si lavora con questo reagente, tra cui protezione per gli occhi, camici da laboratorio, guanti e buone procedure di laboratorio. Smaltire seguendo le normative locali.
- Diluire il cromogeno secondo le istruzioni del produttore (vedi Tabella dei materiali) immediatamente prima dell'uso. Applicare la soluzione cromogena (400 μL) su ciascun pozzetto del set di piastre di scorrimento.
- Incubare per un massimo di 30 minuti a temperatura ambiente. Nelle sezioni positive per la PrPSc (isoforma anomala delle proteine prioniche), di solito è sufficiente un periodo di incubazione di 10 minuti.
- Rimuovere la soluzione cromogena residua lavando i vetrini in acqua distillata. Rimuovere i vetrini dai supporti della piastra di copertura e metterli in un contenitore di plastica con acqua distillata.
