Rilevamento di proteine prioniche anomale nel tessuto cerebrale mediante immunoistochimica

Abstract

Fonte: Orge, L., et al. Rilevamento di proteine prioniche anormali mediante immunoistochimica. J. Vis. Exp. (2023).

Questo video mostra una tecnica per rilevare la proteina prionica mal ripiegata nelle sezioni cerebrali utilizzando l'immunoistochimica. Dopo aver trattato la sezione cerebrale con acido formico per denaturare i prioni e ridurre al minimo il rischio di infezione, oltre a smascherare gli aggregati prionici utilizzando il recupero degli epitopi indotto dal calore, le sezioni vengono immunomarcate per gli aggregati di proteine prioniche mal ripiegate e osservate al microscopio.

Protocol

1. Sezionamento dei tessuti e preparazione dei vetrini

1. Tagliare sezioni di tessuti fissati in formalina e inclusi in paraffina (FFPE) a uno spessore di 3-5 μm utilizzando un microtomo.
2. Far galleggiare le sezioni su acqua purificata con una temperatura di circa 10 °C inferiore al punto di fusione della paraffina utilizzata. Sollevare le sezioni dall'acqua su vetrini da microscopio appositamente trattati (vedi Tabella dei materiali). Lasciare che l'acqua scarichi completamente dagli scivoli.
3. Incubare i vetrini per una notte a 50 °C per migliorare l'adesione dei vetrini dei tessuti.
   nota:

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Etanolo assoluto	Labchem	LB0507-9010	non diluito
			Diluito al 90%, 70% e 50% in acqua distillata
Complesso avidina-biotina e perossidasi Kit Vectastain Elite ABC Perossidasi	Laboratori Vector	PK-6100	Preparare e mescolare delicatamente 30 minuti prima dell'uso secondo le istruzioni del kit. Non mescolare dopo essere stati in piedi.
Anticorpo secondario biotinilato (IgG H+L anti-topo di cavallo)	Laboratori Vector	BA-2000-1.5	Diluire a 1/200 in TBS con il 10% di siero normale di cavallo. Preparare il volume richiesto in base al numero di sezioni.
Cromogeno Diaminobenzidina - DAB, kit substrato, perossidasi	Laboratori Vector	SK-4100	Preparare prima dell'uso secondo le istruzioni del kit. Utilizzare 400 μl di soluzione per sezione.
Camera a pressione Pascal di DakoCytomation	DAKO	Episodio 2800
Ematossilina di Ehrlich:
Etanolo assoluto	Labchem	LB0507-9010
Acido acetico glaciale	Merck	Codice 101830
Allume di potassio	Merck	Codice 1.01047.1000
glicerina	Merck	Codice 1.04091.1000
Soluzione endogena di perossidasi in blocco (concentrazione al 3% H2O2):			40 mL di perossido di idrogeno (30% p/p) in 360 mL di metanolo. Preparare prima dell'uso
Perossido di idrogeno (30% p/p)	Scharlau	HI0136
metanolo	Sigma Aldrich	Codice 322415-2L
Acido formico 98%	Merck	Codice 1.00264.1000	non diluito
microtomo	Shandon-AS325	microtomo	Shandon-AS325
Siero normale (20%) soluzione in blocco in TBS: Siero normale per cavalli	Gibco	16050-122	Preparare il volume finale in base al numero di sezioni del saggio (200 μl di soluzione per sezione).
Anticorpo primario anti-PrP Mouse MAb 2G11	BIORAD	MCA2460	PrP 146-R154R171182 Ovini compresa la scrapie atipica, cervina, felina. Non adatto per bovini. In base al numero di sezioni del test (200 μL di soluzione per sezione) e alla diluizione dell'anticorpo, preparare il volume finale in TBS integrato con il 10% del siero normale della specie in cui è stato sollevato l'anticorpo secondario (siero normale di cavallo) Diluizione anticorpale usuale: MAb 2G11 1/100 ma la diluizione di lavoro dovrebbe essere stabilita in ogni nuovo lotto per ottenere la concentrazione per fornire l'etichettatura più forte con il fondo più basso. Per la conservazione, congelare volumi di aliquote di almeno 10 μl in microprovette sterili. Scongelare e utilizzare un'aliquota alla volta.
Anticorpo primario anti-PrP Mouse MAb 12F10	Azienda chimica delle Cayman	Codice: 189710	PrP142-160 Bovino, non adatto all'ovino Diluizione anticorpale abituale: 1/200 ma deve essere stabilita anche la diluizione operativa. Preparati come MAb 2G11
Camera Shandon CoverplateTM	Termo Scientifico	72110017
Shandon Sequenza® Centro di colorazione immunitaria	Termo Scientifico	73300001
Shandon Sequenza® Immunstaining portavetrini	Termo Scientifico	73310017
Soluzione tampone citrato (10 mM pH 6,1):			2,55 g di citrato trisodico diidrato e 0,255 g di acido citrico in un litro di acqua purificata. Regolare il pH della soluzione di lavoro a 6,1 utilizzando 10 mM di soluzione di acido citrico (1,05 g di acido citrico in 500 mL di acqua purificata) Preparare il giorno del test.
Citrato trisodico diidrato	Sigma-aldrich	S4641-500G
acido citrico	Sigma Aldrich	Codice: C0759
Barattolo e cestello per la colorazione	Deltalab	Anno 19360
		Anno 19361
Vetrini per microscopio Superfrost Plus	VWR	Codice 631-0108
Soluzione salina tamponata a tre (TBS) (50 mM DI BASE TRIZMA; 0,8% NaCI; pH 7,6):			10xTBS (soluzione madre 0,5 M TRIZMA BASE; 8% NaCI; pH 7,6): TRIZMA BASE 60,57 g e NaCl 80 g in 800 ml di acqua purificata. Regolare il pH della soluzione madre utilizzando acido cloridrico al 37% e il volume finale a un litro con acqua purificata (mantenere 5± 3 °C fino a 2 mesi) Diluire la soluzione madre TBS 1/10 il giorno del saggio.
BASE TRIZMA	Sigma Aldrich	T6066-1KG
Cloruro di sodio (NaCl)	Merck	106404
xilene	Reagenti Panreac Applied Chem ITW	251769	non diluito