1. Preparazione degli immunogeni
- Far crescere ciascun ceppo cianobatterico nel terreno di coltura corrispondente nelle condizioni descritte nella Tabella 1.
NOTA: Il terreno di coltura e le condizioni di coltura per ciascun ceppo di cianobatteri sono elencati nella Tabella 1. Tutti i ceppi cianobatterici, ad eccezione del K17, appartengono al gruppo di Antonio Quesada dell'Università Autonoma (Madrid, Spagna). L'anticorpo contro il Planktothrix rubescens è stato generato da un campione naturale della fioritura monospecifica di questo cianobatterio proveniente dal bacino idrico di Vilasouto (Spagna settentrionale).
- Quantificare il numero di cellule utilizzando una camera di conteggio cellulare mediante microscopia ottica per ottenere circa 10-8 cellule/mL da una coltura in fase di crescita esponenziale tardiva o stazionaria.
- Raccogliere cellule da 5 mL di coltura mediante centrifugazione a 2.000 x g per 5 min.
- Scartare il surnatante e risospendere le cellule in una provetta da 10 mL con 5 mL di soluzione fisiologica tamponata con fosfato 1x (1x PBS) per ottenere circa10-8 cellule/mL.
- Omogeneizzare e lisare le cellule della sospensione mediante sonicazione per 5 cicli, da 30 s ciascuno, con una pausa da 30 a 60 s sul ghiaccio, utilizzando un processore a ultrasuoni portatile o immergendo il tubo nel bagno d'acqua di un disgregatore cellulare alla massima ampiezza (30 kHz).
- Ripetere i passaggi 1.3 - 1.5 per ogni ceppo di cianobatterio.
NOTA: La sonicazione produce la distruzione cellulare e il rilascio di contenuto cellulare. Mentre le proteine e i polisaccaridi sono buoni immunogeni, molecole specifiche, come i lipidi e gli acidi nucleici, non inducono da sole una risposta immunogenica umorale. Pertanto, devono legarsi a trasportatori, come polisaccaridi o proteine, per aumentare la complessità molecolare. Inoltre, la sonicazione rilascia materiale intracellulare che può innescare la produzione di anticorpi.
2. Produzione di anticorpi policlonali
- Preparare la prima dose di immunogeno mescolando 0,5 mL del lisato cellulare ultrasonicato ottenuto nella fase 1.5 con 0,5 mL di adiuvante completo di Freund. Consegnarlo all'operatore di una struttura per animali per la produzione di anticorpi policlonali di coniglio.
- Preparare altre tre dosi come prima per un ulteriore utilizzo come potenziamento della memoria nel processo di produzione di anticorpi mescolando 0,5 mL dello stesso omogenato/lisato ottenuto nella fase 1.5 con 0,5 mL di adiuvante di Freund incompleto. Consegnali alla struttura animale per completare il processo di produzione degli anticorpi.
- Ripetere i passaggi 2.1 e 2.2 per ogni nuovo processo di produzione di anticorpi.
NOTA: Normalmente, la produzione di anticorpi è affidata a strutture o aziende specializzate per animali perché sono necessarie licenze e formazione adeguate per lavorare con gli animali. Le aziende forniscono un test ELISA (Relative-Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) per la misurazione della quantità di anticorpi antigene-specifici presenti nel campione di siero.
3. Purificazione degli anticorpi
- Purificare la frazione di immunoglobuline G (IgG) sia dal siero immunitario che da quello pre-immunitario raccolti nella fase 2 mediante cromatografia di affinità con proteina A. Alcuni kit di purificazione commerciali, basati su sistemi a cartuccia, funzionano bene; Segui le istruzioni del fornitore.
- Quando il kit di purificazione non fornisce un sistema di desalinizzazione, sostituire il tampone dopo l'eluizione degli anticorpi purificati a 0,1x PBS, mediante dialisi o utilizzando dispositivi di filtraggio centrifugo con una dimensione dei pori della membrana di 100 kDa (o inferiore).
- Determinare la concentrazione di anticorpi misurando l'assorbanza a 280 nm o utilizzando metodi colorimetrici, come l'acido Bradford, Lowry o Bicinchoninic (BCA).
NOTA: È importante evitare di includere gruppi amminici nel tampone di eluizione (ad esempio, tamponi Tris) perché competono con l'anticorpo per il legame con superfici solide attivate con gruppi epossidici. Dopo la purificazione, è importante testare l'attività anticorpale con ELISA.
4. Marcatura degli anticorpi a fluorescenza
- Etichettare gli anticorpi purificati ottenuti nella sezione 3 con un fluorocromo (ad esempio, un colorante fluorescente rosso lontano) sciogliendo una fiala commerciale contenente colorante per la marcatura di 1 mg di proteina in 100 μL di dimetilsolfossido (DMSO). Aggiungere 2 μl del colorante disciolto a ciascuna preparazione di anticorpi a una concentrazione di 2 mg/mL in un volume finale di 50 μl in soluzione salina tamponata con fosfato da 50 mM (pH 8,5).
- Mantenere le reazioni di marcatura in agitazione continua per 1 ora a temperatura ambiente e 1.200 giri/min su una piattaforma vibrante.
- Purificare gli anticorpi marcati mediante cromatografia ad esclusione dimensionale (ad esempio, utilizzando un gel con un intervallo di frazionamento compreso tra 1,5 e 30 kDa intrappolato in una colonna), seguendo le raccomandazioni del fornitore.
- Misurare l'assorbanza a 280 nm e a 650 nm negli eluati e calcolare l'efficienza di etichettatura seguendo le raccomandazioni del fornitore.
NOTA: È possibile eseguire fino a 50 reazioni di marcatura degli anticorpi da 50 μL con una singola fiala del colorante fluorescente per la marcatura di 1 mg di proteine. Si consiglia di coprire le provette con un foglio di alluminio o, in alternativa, di utilizzare provette opache da 0,5 mL per evitare processi di tempra dopo il passaggio 4.3. Per gli anticorpi IgG, la marcatura ottimale si ottiene con 3-7 mol di colorante per mol di anticorpo.
5. Produzione di CYANOCHIP
- Anticorpi e controlli nella soluzione di stampa
- Preparare 30 μL di ciascun anticorpo purificato in soluzione di stampa mescolando ciascun anticorpo a 1 mg/mL in un tampone di stampa proteica 1x commerciale con Tween 20 allo 0,01% (v/v) (un detergente non ionico), il tutto come concentrazioni finali.
NOTA: In alternativa, una soluzione anticorpale può contenere il 20% di glicerolo, l'1% (p/v) di saccarosio (o trealosio, come conservante) e lo 0,01% (v/v) di Tween 20 in tampone carbonato (pH 8,5).
- Preparare 30 μL della soluzione di stampa come controlli: (a) 1x tampone per la stampa delle proteine con 0,01% (v/v) Tween 20, (b) siero preimmune purificato con proteina-A a 1 mg/mL in 1x tampone per la stampa delle proteine con 0,01% (v/v) Tween 20 e (c) albumina sierica bovina (BSA) a 1 mg/mL in 1x tampone per la stampa delle proteine con 0,01% (v/v) Tween 20.
- Preparare 30 μL di siero pre-immune purificato marcato in fluorescenza a diverse concentrazioni (ad esempio, da 50 μg/mL a 1 μg/mL) in 1x tampone di stampa proteica con Tween 20, come al punto 5.1.1. Questi campioni saranno utilizzati come marcatori di frame fluorescenti e per la quantificazione della fluorescenza relativa dopo lo spotting.
- Aggiungere 30 μl per pozzetto delle soluzioni di stampa preparate nei passaggi 5.1.1, 5.1.2 e 5.1.3 alle micropiastre a 384 pozzetti di altissima qualità per la produzione di microarray, come il polipropilene.
NOTA: Il tampone per la stampa delle proteine aumenta la qualità e la stabilità degli anticorpi e Tween 20 omogeneizza la morfologia dei punti e costruisce l'accoppiamento delle proteine. Si consiglia di mantenere la micropiastra a 384 pozzetti a 4 °C prima dell'uso. Conservarlo a -20 °C per lunghi periodi di tempo. Il polipropilene ha un basso contenuto di DNA, proteine, estratto cellulare e legame intrinseco con piccole molecole.
- Stampa di anticorpi su un vetrino da microscopio
NOTA: Stampare gli anticorpi su vetrini da microscopio attivati utilizzando diverse piattaforme array, come dispositivi a contatto, ad ago diviso o senza contatto, come stampanti piezoelettriche o tecnologie "a getto d'inchiostro". In questo lavoro, il CYANOCHIP è stato stampato di routine per contatto utilizzando un sistema robotico (arrayer) in grado di individuare quantità di nL degli anticorpi su scala μm.
- Impostare le condizioni ambientali della sala stampa a 20 °C e 40 - 50% di umidità relativa.
- Impostare i substrati del vetrino (ad esempio, vetrini per microscopio attivati con resina epossidica da 75 x 25 mm) per eseguire diversi array di anticorpi identici su ciascun vetrino.
- Individuare ogni anticorpo purificato, compresi i controlli e il quadro di riferimento, in un pattern di punti triplicato; in queste condizioni, gli spot hanno un diametro di 180 - 200 μm.
- Dopo la stampa, lasciare le diapositive per almeno 30 minuti a temperatura ambiente per farle asciugare, quindi conservarle a 4 °C; per lavorare sul campo, le diapositive possono essere trasportate e conservate a temperatura ambiente per diversi mesi.
NOTA: Il CYANOCHIP è stampato in un formato di microarray spot triplicato con 3 x 8 microarray identici per vetrino o 9 array identici in un formato di microarray 1 x 9. Ogni dimensione dell'array non deve essere superiore alle dimensioni della camera di reazione per una guarnizione a 24 pozzetti (di solito 7,5 x 6,5 mm in una camera di ibridazione 3 x 8).
- Prima di utilizzare il microarray per analizzare campioni ambientali, utilizzare il dosaggio immunologico a sandwich fluorescente (FSMI) per determinare la diluizione di lavoro per ciascun anticorpo in una curva di titolazione. Per ogni anticorpo, utilizzare una concentrazione standard dell'immunogeno corrispondente (103 - 104 cellule/mL) e diluizioni seriali dell'anticorpo fluorescente (tra 1:500 e 1:32.000). La concentrazione ottimale di anticorpi corrisponde al 50% dell'intensità massima del segnale ottenuta nella curva di titolazione. Inoltre, è necessario determinare la sensibilità e la specificità di ciascun anticorpo, come descritto in Blanco et al.
6. Preparazione di estratti di multianalita ambientale per il test immunologico su microarray a sandwich fluorescente (FSMI)
- Estratto multianalita da un campione liquido
- Prelevare da 1 a 100 mL di campione liquido con una siringa sterile (ad esempio, acqua dalla riva di un serbatoio d'acqua); la quantità di campione dipende in larga misura dalla potenziale concentrazione dei bersagli.
- Concentrare le cellule facendo passare il campione d'acqua attraverso un filtro in policarbonato di 3 μm di pori e 47 mm di diametro; una concentrazione cellulare compresa tra 103 e 108 cellule/mL è auspicabile per la rilevazione positiva, ma la concentrazione effettiva è sconosciuta.
- Recuperare la biomassa raccolta nel filtro con 1 mL di soluzione fisiologica tamponata con Tris modificata, tampone rinforzato con Tween 20 (TBSTRR; 0,4 M Tris-HCl (pH 8), 0,3 M NaCl e 0,1% Tween 20) raschiandola con una spatola in una provetta da 15 mL.
- Omogeneizzare e disaggregare utilizzando un processore a ultrasuoni portatile, come descritto al punto 1.5, o semplicemente pipettando su e giù più volte; questo prepara il campione per l'analisi da parte del microarray.
- Estratto multianalita da un campione solido
- Pesare fino a 0,5 g di campione solido (ad es. roccia, terreno o sedimenti) in una provetta da 10 ml e aggiungere fino a 2 ml di TBSTRR.
- Sonicare immergendo la sonda del sonicatore nel tubo, immergendo il tubo nel bagno d'acqua di un potente corno del sonicatore o utilizzando un sonicatore portatile. Eseguire almeno 5 cicli di 30 secondi a 30 kHz, fermandosi per 30 secondi mentre si è sul ghiaccio.
- Filtrare per rimuovere sabbia, argilla e altro materiale grossolano con una siringa da 10 ml accoppiata a un portafiltro in nylon da 10 a 12 mm di diametro e pori da 5 a 20 μm. Spingere il campione attraverso il filtro in una provetta da 1,5 mL. Se il filtro si satura, agitare la sospensione nella siringa e portarla in una nuova; In questo modo si prepara il materiale filtrato per il test immunologico (fase 7).
NOTA: La capacità di buffering di TBSTRR dipende dal tipo di campione. È importante eseguire il test immunologico immediatamente dopo la preparazione dell'estratto ambientale per evitare l'effetto della degradazione enzimatica sugli analiti. In alternativa, aggiungere inibitori della proteasi all'estratto ambientale e congelare a -80 °C fino al passaggio successivo.
7. Immunodosaggio su microarray a sandwich fluorescente (FSMI)
- Blocco del CYANOCHIP
NOTA: Immediatamente prima dell'uso, trattare i vetrini stampati per bloccare tutti i gruppi epossidici liberi sul vetrino e per rimuovere l'eccesso di anticorpi non legati in modo covalente.
- Immergere il microarray in Tris-HCl 0,5 M (pH 9) con una soluzione BSA al 5% (p/v) su una superficie pulita (ad es. piastra di Petri o una provetta da 50 mL) agitando leggermente da una piattaforma a bilanciere per 5 minuti. In alternativa, appoggiare il vetrino su una goccia da 100 a 200 μL della soluzione di cui sopra con i punti del microarray rivolti verso di essa. Lasciare agire per 3 - 5 minuti e poi procedere.
- Raccogliere con cautela il vetrino utilizzando una pinza con punta in plastica; cercare di evitare di toccare le zone del microarray. Elimina l'eccesso di liquido battendo delicatamente il vetrino su un tovagliolo di carta. Immergerlo in Tris-HCl 0,5 M (pH 8) con una soluzione BSA al 2% (p/v) per 30 minuti agitando leggermente da una piattaforma a bilanciere.
- Asciugare il vetrino eseguendo una breve centrifugazione (200 - 300 x g per 1 minuto) utilizzando una microcentrifuga commerciale adattata per vetrini da microscopio. In alternativa, asciugare il vetrino battendo delicatamente su un tovagliolo di carta.
- Incubazione dell'estratto del campione multianalita con il microarray
- Installare il vetrino in una cassetta di ibridazione per microarray commerciale con 24 pozzetti per più microarray; seguire le istruzioni del fornitore.
- Dopo l'assemblaggio del vetrino e della cassetta, pipettare fino a 50 μl dell'estratto del campione o una diluizione di esso in TBSTRR in ciascun pozzetto della cassetta.
- Ripetere il passaggio 7.2.2 per ogni campione da analizzare.
- Come controllo in bianco, pipettare 50 μl di tampone TBSTRR in almeno due pozzetti separati della cassetta.
- Incubare a temperatura ambiente per 1 ora con miscelazione pipettando ogni 15 minuti o lasciandolo agitare leggermente. In alternativa, incubare per 12 ore a 4 °C.
NOTA: Utilizzare altre guarnizioni di incubazione in funzione del modello di microarray. Il tempo e la temperatura dell'incubazione nella fase 7.2.5 sono parametri empirici che normalmente dipendono dall'affinità e dalla cinetica di legame di ciascun antigene-anticorpo accoppiato.
- lavaggio
- Rimuovere i campioni posando la cassetta e battendola con cura su una carta pulita e assorbente.
- Lavare i pozzetti aggiungendo 150 μL di TBSTRR a ciascuno ed eliminare il tampone, come sopra.
- Ripetere il passaggio 7.3.2 altre tre volte.
- Incubazione con anticorpi rivelatori fluorescenti
- Aggiungere 50 μl di una miscela di anticorpi contenente i 17 anticorpi anti-ceppo cianobatterico, ciascuno marcato con il fluorocromo in TBSTRR con l'1% (p/v) di BSA. Determinare la concentrazione di ciascun anticorpo fluorescente nella miscela (da 0,7 a 2 μg/mL) eseguendo esperimenti di titolazione di ciascuna coppia antigene/anticorpo.
- Incubare per 1 ora a temperatura ambiente, come descritto al punto 7.2.5, o per 12 ore a 4 °C.
- Lavaggio degli anticorpi fluorescenti
- Rimuovere gli anticorpi fluorescenti non legati, come al punto 7.3.
- Smontare la cassetta e immergere il vetrino in PBS 0,1x (ad es. in una provetta da 50 ml) per un rapido risciacquo.
- Asciugare la slitta come al punto 7.1.3.
8. Scansione per la fluorescenza
- Scansionare il vetrino per la fluorescenza al picco di fluorescenza di massima emissione per il colorante fluorescente rosso lontano in uno scanner per la fluorescenza. Scatta diverse immagini dei microarray con diversi parametri di scansione, generalmente abbassando il valore di guadagno del laser.
nota: Evita le macchie sature (> 65.000 conteggi di fluorescenza): sono fuori scala e possono introdurre errori di quantificazione.
Tabella 1. Elenco degli anticorpi (Abs) e dei ceppi cianobatterici utilizzati per produrre il CYANOCHIP.
| Codice Ab | Immunogen (ceppo) | ordine | habitat | Medio | Condizioni di coltura |
| K1 | Anabaena sp. | Nostocales | sconosciuto | BG11 e nitrato | 30 ºC, luce continua |
| K2 | Anabaena sp. | Nostocales | sconosciuto | BG11o | 30 ºC, luce continua |
| K3 | Microcystis flosaquae | Chroococcales | planctonico | BG11 | 28 ºC, luce continua |
| K4 | Microcystis novacekii | Chroococcales | planctonico | BG11 | 28 ºC, luce continua |
| K5 | Microcystis aeruginosa | Chroococcales | planctonico | BG11 | 28 ºC, luce continua |
| K6 | Aphanizomenon ovalisporum | Nostocales | planctonico | BG11o | 28 ºC, luce continua |
| K7 | Phormidium sp. | Oscillatoriales | bentonico | BG11 | 18 ºC, 16-8 fotoperiodo |
| K8 | Rivularia sp. | Nostocales | bentonico | CHU-D | 18 ºC, 16-8 fotoperiodo |
| K9 | Chamaesiphon sp. | Chroococcales | bentonico | BG11 | 18 ºC, 16-8 fotoperiodo |
| K10 | Leptolyngbya boryana | Oscillatoriales | bentonico | BG11 | 18 ºC, 16-8 fotoperiodo |
| K11 | Tolypothrix distorta | Nostocales | bentonico | BG11o | 18 ºC, 16-8 fotoperiodo |
| K12 | Aphanizomenon aphanizomenoides | Nostocales | planctonico | BG11o | 28 ºC, luce continua |
| K13 | Nostoc sp. (Antartide) | Nostocales | bentonico | BG11o | 13 ºC, 16-8 fotoperiodo |
| K14 | Anabaena sp. | Nostocales | bentonico | BG11o | 13 ºC, 16-8 fotoperiodo |
| K15 | Leptolyngbya sp. | Oscillatoriales | bentonico | BG11 | 13 ºC, 16-8 fotoperiodo |
| K16 | Tolypothrix sp. | Nostocales | bentonico | BG11 | 13 ºC, 16-8 fotoperiodo |
| K17 | Planktothrix rubescens | Oscillatoriales | planctonico | nessuno | nessuno |