Immunocolorazione di cellule incapsulate in un sistema di idrogel 3D

Abstract

Fonte: LeSavage, B. L., et al. Produzione di idrogel proteici simili all'elastina per l'incapsulamento e l'immunocolorazione delle cellule in 3D. J. Vis. Exp. (2018).

Questo video mostra una tecnica per l'immunocolorazione delle cellule incapsulate in un idrogel 3D. La coltura di idrogel contenente cellule progenitrici neurali viene fissata, permeabilizzata e trattata con una soluzione bloccante per prevenire l'immunocolorazione non specifica. Viene aggiunto un cocktail di anticorpi primari per legare proteine specifiche, seguito da anticorpi secondari marcati in fluorescenza e da una colorazione nucleare. Il campione viene quindi montato su un vetrino e osservato al microscopio confocale.

Protocollo

1. Incapsulamento cellulare in idrogel di proteine 3D simili all'elastina (ELP)

1. Preparazione stampi in silicone
   1. Utilizzare un punzone per biopsia con il diametro desiderato per creare dei fori in un foglio di silicone di 0,5 mm di spessore e ritagliare un quadrato attorno a ciascun foro. Ripetere per il numero di stampi desiderato.
      NOTA: Il diametro e lo spessore degli stampi possono essere regolati in base alle particolari condizioni di applicazione e coltura cellulare. In pratica, per colture cellulari di 50 x 10⁶ cellule/mL, si consigliano stampi di 0,5 mm di spessore con diametri di 4 mm e 5 mm per un'estrazione sufficiente di DNA/RNA e proteine, rispettivamente. Per l'immunocolorazione, è possibile utilizzare un punzone per biopsia da 2 mm per creare invece tre fori adiacenti per stampo quadrato in modo da poter colorare tre repliche per pozzetto.
   2. Rimuovere l'involucro di plastica su ciascun lato del singolo stampo con una pinzetta.
      nota: Evitare il contatto con la superficie esposta in silicone poiché la contaminazione può ridurre l'efficienza futura del legame al plasma.
   3. Utilizzando una pinzetta, disporre lo stesso numero di stampi in silicone nudo e vetrini coprioggetti (n. 1, diametro 12 mm) in file alternate sul coperchio capovolto di una piastra a 48 pozzetti. Una volta completato, coprire il coperchio della piastra a 48 pozzetti per evitare contaminazioni.
   4. Il plasma di ossigeno tratta l'intero coperchio della piastra a 48 pozzetti (cioè stampi e vetrini). Subito dopo, utilizzare una pinza per capovolgere lo stampo in silicone sul vetrino adiacente. Premere con decisione sullo stampo per garantire l'incollaggio. Lasciare incubare gli stampi a temperatura ambiente per 1 h.
      nota: La durata del trattamento al plasma di ossigeno varia a seconda dello strumento utilizzato. Le condizioni tipiche per il nostro strumento sono una finestra di pressione del gas di esercizio compresa tra 0,3 e 4 mbar, un flusso di ossigeno gassoso a 20 cm³/min e l'esposizione del campione al plasma per 10-20 s.
   5. Sterilizzare gli stampi in autoclave. Conservare gli stampi a temperatura ambiente in un ambiente sterile fino al momento dell'uso.
      nota: Gli stampi possono essere conservati in questa fase a tempo indeterminato.
2. Preparazione di una soluzione madre proteica simile all'elastina
   1. Rimuovere l'ELP liofilizzato dalla conservazione a 4 °C. Riscaldare la proteina a temperatura ambiente prima di aprire il tubo per assicurarsi che non si accumuli condensa sulla proteina durante l'uso ripetuto.
   2. Sciogliere l'ELP nella soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS) a 4 °C con agitazione costante (cioè centrifuga) durante la notte.
      nota: La concentrazione della soluzione madre ELP sarà ulteriormente diluita con l'aggiunta di una soluzione di reticolante a un rapporto volumetrico definito dall'utente. Ad esempio, per una concentrazione finale di ELP al 3% (p/v), preparare una soluzione madre di ELP al 3,75% (p/v) che verrà diluita a un rapporto volumetrico di 4:1 di soluzione ELP:soluzione reticolante. Regolare la concentrazione secondo necessità per l'applicazione desiderata.
   3. Filtro sterile Soluzione madre ELP con filtro per siringa da 0,22 μm. Conservare ELP sul ghiaccio quando non è in uso.
3. Nella cappa di biosicurezza, trasferire gli stampi sterili utilizzando una pinzetta sterile su una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti.
4. Preparazione della soluzione madre di tetrakis(idrossimetil)fosfonio cloruro (THPC)
   1. Diluire il THPC in DPBS appena prima dell'uso. Regolare la concentrazione della soluzione THPC in base alla concentrazione finale di ELP e al rapporto di reticolazione desiderato.
      nota: Per il protocollo, verrà ottenuta una concentrazione finale di ELP del 3% (p/v) mescolando la soluzione madre di ELP con la soluzione THPC a un rapporto volumetrico di 4:1. Regolare se necessario.
   2. Aggiungere 2,6 μL di soluzione THPC (80% in acqua) a 997,4 μL di DPBS.
      nota: Questa concentrazione di THPC corrisponde a un rapporto stechiometrico 1:1 dei gruppi idrossimetilici sul THPC e delle ammine primarie sulla proteina ELP quando si mescolano soluzioni al rapporto volumetrico 4:1 descritto per un idrogel ELP finale del 3% (p/v). La soluzione di THPC è viscosa e le goccioline di soluzione possono attaccarsi al lato del puntale della pipetta. Per concentrazioni accurate, evitare tali goccioline durante la diluizione in DPBS. Spurgare il contenitore di riserva THPC con azoto gassoso per prevenire l'ossidazione della fosfina e l'inattivazione del reticolante.
   3. Agitare la soluzione per mescolare e mantenere in ghiaccio.
   4. Filtrare sterile la soluzione madre di THPC utilizzando un filtro per siringa da 0,22 μm. Diluire ulteriormente la soluzione madre di THPC con DPBS sterile per ottenere rapporti di reticolazione stechiometrica inferiori (ad esempio, 0,5:1 o 0,75:1).
      nota: Il THPC è sensibile all'ossigeno e la soluzione diluita deve essere utilizzata entro poche ore dalla preparazione.
5. Dissociare le cellule mediante incubazione con tripsina-EDTA in una sospensione di una singola cellula, pellettare le cellule e contare le cellule ri-sospese nel terreno utilizzando un emocitometro.
   nota: I protocolli esatti per questa fase dipenderanno fortemente dal tipo di cellula e dall'applicazione desiderati. Per le cellule progenitrici neurali utilizzate in questo protocollo, è stata condotta un'incubazione di tripsina-EDTA allo 0,025% a temperatura ambiente per 1,5 minuti. Le celle sono state pellettate a 200 x g per 2 minuti. Per una maggiore vitalità cellulare, le cellule devono essere sospese in condizioni normali di terreno. Le densità cellulari tipiche utilizzate per l'incapsulamento cellulare variano da 1 a 50 x 10⁶ cellule/mL di volume finale di idrogel. Regolare se necessario.
6. Aliquotare il numero desiderato di cellule in una provetta da centrifuga sterile da 1,5 mL.
7. Centrifugare le celle a ~200 x g per 3 minuti. Aspirare con cautela il surnatante e mantenere il pellet di cella sul ghiaccio.
   nota: È fondamentale aspirare completamente tutto il surnatante per mitigare l'ulteriore diluizione del reticolante ELP e THPC. Le velocità di centrifugazione specifiche variano a seconda del tipo di cella.
8. Risospendere il pellet di cella nella soluzione madre ELP in modo tale che il volume sia l'80% del volume finale (assumendo un rapporto 4:1 tra soluzione ELP/soluzione THPC). Pipettare la miscela 20-25 volte per produrre una miscela omogenea di cellule e ELP.
   nota: Evitare di afferrare il fondo del tubo per mitigare l'aumento della temperatura e la successiva transizione di fase dell'ELP. Ogni stampo da 2 mm con tre repliche richiede 7,5 μL di volume finale (cioè 6 μL di soluzione madre ELP e 1,5 μL di soluzione madre THPC) diviso equamente nei 3 fori (cioè 2,5 μL di volume finale per foro). Per gli stampi da 4 e 5 mm, è richiesto un volume finale rispettivamente di 7,5 μl e 15,5 μl.
9. Aggiungere la soluzione madre di THPC alla sospensione cell/ELP per il restante 20% del volume finale. Pipettare la miscela 20-25 volte per ottenere una miscela omogenea.
10. Pipettare immediatamente i volumi finali corrispondenti della miscela di cellule/ELP/THPC in ogni stampo con un movimento circolare. Ripetere per tutti gli stampi.
11. Incubare i campioni a temperatura ambiente per 15 minuti, seguiti da un'ulteriore incubazione a 37 °C per 15 minuti
    nota: Il primo periodo di incubazione aiuterà a facilitare la reticolazione iniziale dell'idrogel prima di aumentare la temperatura a quella superiore alla temperatura critica della soluzione inferiore (LCST) dell'ELP e indurre la sua segregazione della fase termica.
12. Aggiungere lentamente 750 μl di terreno di coltura cellulare caldo a ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti, evitando di interrompere i gel.
13. Incubare gli idrogel a 37 °C per 7 giorni.
    nota: Si consiglia di cambiare il terreno completo ogni 1-2 giorni a seconda del tipo di cellula. Per limitare lo stress sul gel, utilizzare una pipetta Pasteur in vetro fissata con un puntale da 200 μL quando si aspira il terreno dal pozzetto.

2. Immunocitochimica delle cellule in idrogel ELP 3D

1. Preparare la soluzione di fissazione mescolando 10 mL di paraformaldeide (PFA) al 16% (p/v) in 30 mL di DPBS. Riscaldare la soluzione a 37 °C.
2. Aspirare il terreno dalla piastra a 24 pozzetti e lavare delicatamente con 1 mL di DPBS.
3. Aggiungere 750 μl della soluzione di fissazione a ciascun pozzetto e incubare a 37 °C per 30 minuti. Non utilizzare l'incubatore per colture tissutali per evitare la contaminazione di altre colture con vapori di PFA.
4. Aspirare con cura la soluzione di fissaggio da ciascun pozzetto, gettando il PFA in un contenitore per rifiuti pericolosi appropriato.
   cautela: L'esposizione al PFA può causare irritazione alla pelle e agli occhi. Indossare guanti/occhiali di sicurezza e lavorare in una cappa chimica.
5. Aggiungere 1 mL di DPBS a ciascun campione. Aspirare immediatamente il DPBS e gettarlo nel contenitore dei rifiuti in PFA.
6. Lavare i campioni due volte con 1 mL di DPBS per 10 minuti ciascuno.
   nota: I campioni possono essere conservati in DPBS a 4 °C per un massimo di una settimana dopo la sigillatura della piastra con Parafilm.
7. Permeabilizzare ogni campione con 750 μL di soluzione di permeabilizzazione (100 mL di DPBS e 0,25 mL di Triton X-100; PBST) per 1 h a temperatura ambiente su bilanciere a 15 giri/min.
8. Aspirare il PBST e aggiungere 750 μL di soluzione bloccante (95 mL di PBS, 5 g di albumina sierica bovina (BSA), 5 mL di siero e 0,5 mL di Triton X-100) a ciascun campione. Incubare a temperatura ambiente per 3 ore su un bilanciere a 15 giri/min.
   nota: La soluzione bloccante deve contenere siero della specie ospite in cui sono stati allevati gli anticorpi secondari (ad es. capra, asino) e filtrato sterilemente attraverso un filtro da 0,22 μm prima dell'uso.
9. Preparare la soluzione di diluizione degli anticorpi (97 mL di DPBS, 2,5 g di BSA, 2,5 mL di siero (della stessa specie ospite da cui viene preparato EPL) e 0,5 mL di Triton X-100). Diluire l'anticorpo primario utilizzando la soluzione di diluizione dell'anticorpo e aggiungere 500 μl di soluzione a ciascun campione. Sigillare la piastra con Parafilm e incubare per una notte a 4 °C su un rocker.
   nota: Gli anticorpi primari Nestin e Sox2 sono stati diluiti 1:400 in una soluzione di diluizione anticorpale rispetto alla concentrazione originale dei produttori.
10. Aspirare la soluzione di anticorpi da ciascun campione e lavare i campioni con PBST per 60 minuti a temperatura ambiente su un bilanciere a 15 giri/min. Ripetere la fase di lavaggio 3 volte.
11. Diluire gli anticorpi secondari e 5 mg/mL di DAPI madre (1:2.000) utilizzando la soluzione di diluizione degli anticorpi e aggiungere 500 μL di soluzione a ciascun campione. Coprire la piastra a 24 pozzetti con un foglio di alluminio e incubare per una notte a 4 °C su un bilanciere.
    nota: Poiché gli anticorpi secondari sono sensibili alla luce, i campioni devono essere protetti dal fotosbiancamento per tutte le fasi successive. Gli anticorpi secondari anti-topo di capra e anti-coniglio di capra sono stati diluiti 1:500 in una soluzione di diluizione anticorpale dalla concentrazione originale dei produttori.
12. Aspirare la soluzione di anticorpi da ciascun campione e lavare i campioni con PBST per 30 minuti a temperatura ambiente sul bilanciere. Ripetere la fase di lavaggio 3 volte.
13. Posizionare una goccia di mezzo di montaggio rigido sulla superficie di un vetrino. Usando una pinza, rimuovere la soluzione in eccesso dallo stampo tamponando leggermente il bordo dello stampo su un tovagliolo di carta. Posizionare con cura lo stampo capovolto sul supporto di montaggio ed evitare di introdurre bolle.
14. Lasciare indurire il mezzo di montaggio per 48 ore a temperatura ambiente. Conservare i campioni a temperatura ambiente o a 4 °C. Lasciare che il mezzo di montaggio si solidifichi completamente per 48 ore prima dell'imaging poiché l'indice di rifrazione del mezzo cambierà nel corso dell'indurimento. Sigillare i campioni sul vetrino di copertura con smalto trasparente per mitigare la contaminazione o il movimento del campione.
15. Visualizzare i campioni utilizzando un microscopio confocale.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Incapsulamento cellulare in idrogel 3D ELP
Filtri per siringhe da 0,22 μm	Millipore	SLGV004SL
Foglio di silicone di 0,5 mm di spessore	Scienza della microscopia elettronica	Codice: 70338-05
Piastre per coltura tissutale a 24 pozzetti	Corning	353047
Punzone per biopsia monouso (2 mm)	Integra Miltex	33-31
Punzone per biopsia monouso (4 mm)	Integra Miltex	33-34
Punzone per biopsia monouso (5 mm)	Integra Miltex	33-35
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS)	Corning	21-031-CM
N. 1 vetrino coprioggetti in vetro da 12 mm	Thermo Fisher Scientifico	12-545-80
Tetrakis(idrossimetil)fosfonio cloruro (THPC)	Sigma-Aldrich	404861-100ML
0,5% Tryspin/EDTA	Thermo Fisher	15400054
Immunocitochimica delle cellule in idrogel 3D ELP
16% (p/v) Paraformaldeide (PFA)	Scienze della microscopia elettronica	Codice: 15701
Albumina sierica bovina (BSA)	Roche	3116956001
DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindolo, dicloridrato)	Sonde molecolari	D1306
Siero d'asino	Laboratori biologici Lampire	Codice: 7332100
Anticorpo secondario anti-topo di capra (AF488)	Sonde molecolari	A-11017
Anticorpo secondario anti-coniglio di capra (AF546)	Sonde molecolari	Codice A-11071
Siero di capra	Gibco	Codice 16210-072
Anticorpo primario nestina di topo	BD Pharmingen	556309
Anticorpo primario Sox2 di topo	Tecnologia di segnalazione cellulare	Codice 23064S
smalto per unghie	Scienze della microscopia elettronica	Codice: 72180
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-100ML
Supporto di montaggio rigido Vectashield	Laboratori vettoriali	H-1400