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1. Coniugazione del peptide anticorpale
NOTA: L'acido colico legato a NLS (ChAcNLS) può essere sintetizzato presso qualsiasi produttore di peptidi commerciale o piattaforma di servizi di sintesi di peptidi affiliata all'università.
- In una provetta da microcentrifuga da 1,7 mL, preparare una soluzione da 10 mg/mL (~1 mg di anticorpo totale) di 7G3 in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), pH 7,6.
- Sciogliere il sulfosuccinimidil 4-(N-maleimidometil)cicloesano-1-carbossilato (sulfo-SMCC) in dimetilsolfossido (DMSO) ad una concentrazione di 5-10 mM. Il vorticing completo della soluzione funziona meglio per ottenere la completa dissoluzione.
- Aggiungere alla provetta contenente 7G3 la soluzione di zolfo-SMCC disciolto (tipicamente tra 5-20 μL a seconda del rapporto molare tra solfo-SMCC-to-7G3 desiderato). Si raccomanda di testare i rapporti sulfo-SMCC-to-7G3 di 10, 25 e 50 a 1. Incubare a temperatura ambiente per 1 ora.
- Purificare e concentrare il 7G3 derivatizzato dalla maleimmide utilizzando un dispositivo di ultrafiltrazione e lo scambio di tamponi in PBS, pH 7.0. Centrifugare a 8.000 x g per circa 5 min. Scartare il flusso e riempire con PBS, pH 7.0 e centrifugare nuovamente.
- Eseguire questa operazione 7-8 volte per sostituire completamente il buffer. Recuperare la proteina 7G3 concentrata posizionando il dispositivo filtrante capovolto in una provetta da microcentrifuga pulita. Centrifugare per 2 minuti a 1.000 x g. Il volume di recupero deve essere di circa 0,3 ml.
- Nella provetta contenente il 7G3 attivato dalla maleimmide, aggiungere un eccesso molare di 2 volte di ChAcNLS rispetto al rapporto sulfo-SMCC-to-7G3 utilizzato nel passaggio precedente e incubare per una notte a 4 °C. Ad esempio, se è stato utilizzato un rapporto 10 a 1 tra solfo SMCC e 7G3, utilizzare un rapporto tra ChAcNLS e 7G3 di 20 a 1. Il volume totale non deve essere modificato in modo significativo.
nota: Sebbene ChAcNLS non causi precipitazioni durante il processo di coniugazione, questa è una possibilità che potrebbe verificarsi con altri peptidi. Osservare il tubo durante la reazione per segni di precipitazione, che è molto probabilmente causata quando i peptidi sono idrofobici. In questi casi, potrebbe valere la pena rivisitare il peptide di interesse al fine di progettare modifiche per fornire una maggiore idrofilia.
- Concentrare il 7G3-ChAcNLS utilizzando un dispositivo di ultrafiltrazione alla concentrazione desiderata e allo scambio di tamponi in PBS pH 7,4 (vedere il passaggio 1.4). La resa di recupero delle proteine totali dovrebbe essere ≥ il 75% del materiale di partenza originale.
- Eseguire l'elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE) per valutare i candidati 7G3-ChAcNLS costruiti utilizzando un gel di poliacrilammide al 12% (fornisce una separazione sufficiente delle catene pesanti e leggere coniugate ChAcNLS dalle catene non coniugate). Miscelare 10 μg di 7G3-ChAcNLS nel tampone di caricamento PAGE contenente 2 μL di β-mercaptoetanolo e caricarlo nel pozzetto.
- Impostare la tensione appropriata (120 V per 1 ora per un gel al 12%) ed eseguire l'elettroforesi. Interrompere l'elettroforesi quando il fronte del colorante Coomassie raggiunge il fondo del gel.
nota: Non lasciare che la parte anteriore del colorante Coomassie scorra dal gel.
- Rimuovere il gel dall'apparecchio per elettroforesi e risciacquare con una soluzione decolorante contenente il 10% v/v di acido acetico glaciale e il 20% v/v di metanolo.
- Scatta una foto del gel e con un righello e misura la distanza (cm) migrata per gli standard e i coniugati 7G3. Calcola il valore del fattore di ritenzione (Rf), che è la distanza percorsa divisa per la lunghezza del gel (da dove la proteina viene caricata al fronte di migrazione di Coomassie). Tracciare il peso molecolare (MW) in log rispetto ai valori Rf di ogni standard proteico ed estrapolare la dimensione dei coniugati 7G3.
- Calcolare il numero di peptidi per anticorpo dividendo la differenza in MW tra i coniugati 7G3 e 7G3 non modificato per 1768,5 g/mol (MW di ChAcNLS).
- Scatta immagini digitali del gel colorato con Coomassie ed esegui l'analisi densitometrica. A questo punto, la selezione di un candidato principale può essere basata sull'AC con il numero massimo di molecole ChAcNLS che non contiene specie aggregate significative.
2. Microscopia confocale per la valutazione dell'accumulo intracellulare
NOTA: È importante testare la selettività cellulare dell'accumulo intracellulare degli anticorpi monoclonali modificati con peptidi prima di sviluppare formulazioni con un carico utile di interesse. Poiché è stato dimostrato che Tat ha anche una propensione alla penetrazione cellulare aspecifica, vale la pena analizzare prima l'accumulo intracellulare e la selettività cellulare prima di intraprendere costose fasi di sviluppo con carichi utili costosi. Per questo motivo, la Procedura 1 dovrebbe anche modificare gli anticorpi monoclonali di controllo irrilevanti specifici per isotipo. Per il resto del protocollo, lavoreremo con AC modificati con 10 molecole di ChAcNLS per anticorpo. Uno schema che include i passaggi chiave per le procedure 2 e 3 è descritto nella Figura 1.
ATTENZIONE: Questa fase del protocollo prevede la manipolazione e la manipolazione della paraformaldeide. Si prega di seguire le istruzioni del produttore durante la manipolazione.
- Trattare le cellule bersaglio TF-1a con 200 nM di 7G3-ChAcNLS, inclusi mAb di controllo modificati. Incubare 5 x 106 cellule antigene-positive con i coniugati per 1 ora a 37 °C.
- Dopo 1 ora, rimuovere il surnatante e lavare con 1 ml 3x in PBS ghiacciato. Aggiungere terreno fresco e incubare per un'altra ora a 37 °C.
- Dopo l'ora aggiuntiva, rimuovere il surnatante e lavare 3 volte in 1 ml di PBS ghiacciato. Aggiungere 0,5 mL di PBS contenente lo 0,25% di tripsina e acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) a 37 °C per 3 fino a 30 minuti.
nota: Durante i test pilota iniziali si raccomanda di non tripsinizzare le cellule per determinare le differenze nell'accumulo intracellulare di AC. Questo protocollo promuove l'uso della tripsina e dimostriamo come ciò migliori la valutazione dell'efficienza di accumulo intracellulare di diversi candidati AC.
- Testare i diversi tempi di incubazione controllando visivamente la presenza di tutte le cellule staccate. Inoltre, incubare aliquote cellulari con soluzioni di colorazione vitali ed eseguire l'analisi citofluorimetrica come descritto in precedenza.
- Neutralizzare la tripsina con 1,5 mL di coltura cellulare RPMI 1640 media/10% siero fetale bovino. Centrifugare le celle a 500 x g per 5 minuti, rimuovere il surnatante e lavare 3 volte in 0,5 mL di PBS ghiacciato.
- Fissare le cellule in 0,5 mL di PBS contenente l'1% di paraformaldeide e l'1% di saccarosio su ghiaccio per 30 min. Lavare le cellule 3 volte in 0,5 mL di PBS ghiacciato e centrifugare a 250 x g per 5 min. Permeabilizzare le cellule in 0,5 mL di PBS contenente lo 0,15% di Triton X-100 per 5 min su ghiaccio. Lavare le celle in PBS ghiacciato e ripetere la centrifugazione.
- Sospendere le cellule in 0,1 mL di PBS contenenti 2 μg/mL (o la concentrazione raccomandata dal produttore) di un anticorpo policlonale secondario Fc anti-murino (isotipo specifico) coniugato ad AlexaFluor 647 per 1 ora a temperatura ambiente al buio.
- Centrifugare a 250 x g per 5 minuti e lavare le celle 3 volte in 0,5 mL di PBS ghiacciato. Sospendere le celle in 0,5 mL di PBS.
pausa: Le celle possono essere conservate in frigorifero.
nota: È essenziale selezionare un anticorpo secondario che riconosca l'isotipo corretto dell'anticorpo monoclonale di interesse. AF647 è stato scelto per la sua emissione nel lontano infrarosso, che non interferisce con la colorazione con ioduro di propidio (PI) del nucleo.
- Aggiungere PI a una concentrazione di 10 μg/mL nel contenitore con le cellule. Quindi, montare 1 x 105 celle su vetrini utilizzando supporti di montaggio e coprire con un vetrino coprioggetti.
- Esamina le cellule con un obiettivo a immersione in olio Plan Apo 60X NA 1.42 su un microscopio confocale a scansione laser invertita. Rileva la fluorescenza PI utilizzando il laser ad argon da 488 nm e il prisma a scansione spettrale impostato per 600 - 650 nm. Per la fluorescenza AF647 utilizzare il laser elio-neon da 633 nm e il prisma a scansione spettrale impostato per 650 - 700 nm. Raccogli le emissioni di fluorescenza da PI e AF647 in sequenza.
nota: Utilizzare la stessa impostazione durante la valutazione e il confronto delle celle. Tuttavia, sarà necessario regolare le impostazioni per le celle tripsinizzate rispetto alle celle non tripsinizzate.
- Utilizzare il software del microscopio per acquisire le immagini. Raccogli immagini utilizzando sezioni ottiche orizzontali seriali di 1.024 x 1.024 pixel con una media delle linee 2X scattata a intervalli di 0,5 μm attraverso l'intero spessore della cella. Presenta le immagini come proiezioni z impilate da quattro sezioni consecutive alla massima intensità di fluorescenza.
- Analizza le cellule con il software del microscopio. Registrare il modello di distribuzione cellulare dei coniugati. In particolare, valutare se la fluorescenza intracellulare nel citoplasma è raggruppata e vicina alla superficie cellulare o diffusa e omogenea. Valutare anche l'intensità relativa della fluorescenza per cellula.
