Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione del catetere prima della chirurgia stereotassica
- Cateteri in PE50 tagliati (6 cm di lunghezza) che verranno utilizzati per collegare la cannula con le pompe osmotiche (vedi Figura 1). Riempire i cateteri PE50 con liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) e sigillare entrambe le estremità dei cateteri. Conservare il catetere a 4 °C fino al momento dell'utilizzo.
2. Impianto di cannule mediante stereotassia
- Eseguire l'intervento chirurgico in condizioni sterili. Sterilizzare tutti gli strumenti e i materiali chirurgici mediante autoclave. Pulire accuratamente l'apparato stereotassico e l'area di lavoro e disinfettare con una soluzione di etanolo al 70%. Indossare una maschera chirurgica, una cuffia per capelli e guanti sterili.
- Anestetizzare i ratti iniettando per via intraperitoneale (i.p.) una soluzione di ketamina e xilazina (rispettivamente 100 mg/kg e 10 mg/kg). Confermare l'anestesia controllando il movimento dopo un leggero pizzicamento delle dita dei piedi.
- Iniettare un farmaco antinfiammatorio non steroideo (Meloxicam; 1 mg/kg) per via sottocutanea (s.c.) all'animale anestetizzato almeno 30 minuti prima dell'intervento chirurgico.
- Radere la testa dell'animale utilizzando le tosatrici e disinfettare la pelle tre volte con una soluzione di clorexidina gluconato al 2% e alcol isopropilico al 2%. Applicare un unguento oftalmico veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
- Posiziona l'animale su una cornice stereotassica con le barre auricolari. Fissare una cannula sul braccio di supporto della montatura stereotassica. Iniettare (s.c.) un agente anestetico locale (bupivacaina (1,5 mg/kg) e lidocaina (1,5 mg/kg) sulla parte superiore della testa. L'anestesia viene mantenuta durante l'intera procedura posizionando un cono nasale che eroga isoflurano al 3%. L'intero campo chirurgico dovrebbe essere drappeggiato, ma non è stato fatto qui per dimostrare meglio la tecnica.
- Fai un'incisione di 3 cm sulla sommità della testa con un bisturi. Installa 4 morsetti attorno all'incisione per lasciare il cranio libero. Utilizzando una forbice a punta tonda, praticare una tasca (2 x 2 cm2) sotto la pelle tra le scapole dell'animale.
- Raschiare il periostio del cranio con una lama. Applicare una garza sul cranio se sanguina.
- Verificare che il cranio sia piatto e ben allineato sul telaio stereotassico. Per assicurarti che il cranio sia piatto, controlla le coordinate dell'altezza alla bregma e alla lambda. Prendi le coordinate bregma che verranno utilizzate come punto di riferimento.
- Partendo dal bregma, calcolare le coordinate delle due cannule guida che verranno impiantate bilateralmente nell'ippocampo (anteroposteriore: - 0,42 cm; mediolaterale: ± 0,30 cm; dorso-ventrale: - 0,28 cm secondo l'atlante cerebrale di ratto di Paxinos e Watson). Indicare la posizione della cannula con un pennarello.
- Praticare un foro (0,5 mm) nel cranio nel punto di impianto di entrambe le cannule. Praticare altri due fori a circa 5 mm sopra e sotto quei punti per inserire le viti che solidificheranno la cannula durante l'applicazione del cemento dentale.
- Tagliare un'estremità del catetere precedentemente riempito con aCSF con un bisturi e inserirlo nel braccio angolare della cannula. Fissare la prima cannula con cemento dentale. Evitare di mettere del cemento dentale intorno alla posizione sulla seconda cannula.
- Lasciare asciugare il cemento dentale per 2 - 3 minuti, quindi rimuovere il braccio del supporto dalla prima cannula e fissare la seconda cannula al suo interno. Ripetere i passaggi 2.11 e 2.12. Mettere una cannula fittizia su entrambe le cannule guida. Assicurarsi che il ciuccio e la cannula guida abbiano la stessa lunghezza per evitare l'infiltrazione e il blocco dei tessuti della cannula.
- Inserire l'estremità libera di entrambi i cateteri nella tasca precedentemente praticata tra le scapole dell'animale. Rimuovere le pinze e cucire la pelle con un filo di sutura 4-0.
nota: La cannula guida superiore deve essere accessibile per le prossime infusioni di Aβo.
- Togliete l'animale dal telaio stereotassico e rimettetelo nella sua gabbia. Durante il recupero post-operatorio, posizionare la gabbia su una coperta di acqua riscaldante fino a quando l'animale non si sveglia. La gabbia dovrebbe essere parzialmente sul tappetino in modo che il topo possa sfuggire al calore se necessario. Monitorare costantemente l'animale fino a quando non riacquista una coscienza sufficiente per mantenere la decubito sternale.
- Riportare i ratti alla struttura per animali per riprendersi dall'intervento chirurgico per 10 giorni sotto stretto monitoraggio.
nota: Non restituire un animale che ha subito un intervento chirurgico in compagnia di altri animali fino a quando non si è completamente ripreso. Meloxicam (1 mg/kg) viene somministrato una volta al giorno per due giorni dopo l'intervento chirurgico per il trattamento del dolore.
3. Installazione della pompa osmotica
- Un giorno prima dell'installazione, riempire le pompe osmotiche con l'anticorpo 6E10 (1 mg/ml; 100 μl) e l'anticorpo IgG1 di controllo (1 mg/ml; 100 μl) secondo le istruzioni del produttore in condizioni sterili. Tenere le pompe in acqua distillata sterile a 37 °C per una notte per attivare le pompe.
- Anestetizzare i ratti con isoflurano al 3% per installare pompe osmotiche (0,5 μl/ora per 7 giorni). Radersi tra le scapole e disinfettare la pelle con una soluzione di clorexidina gluconato 2% e alcol isopropilico 2%. Praticare un'incisione di 2 cm con un bisturi tra le scapole per individuare i cateteri PE50 collegati alla cannula guida.
- Tagliare l'estremità dei cateteri PE50 contenenti cemento dentale con un bisturi. Collegare le pompe osmotiche ai cateteri PE50 e aggiungere un po' di cemento dentale alla giunzione della pompa e del catetere per garantire il collegamento.
- Cucire saldamente la pelle con un filo di sutura 4-0. Rimetti l'animale nella sua gabbia su un cuscinetto d'acqua riscaldante. Osservare l'animale svegliarsi rapidamente da un'anestesia con isoflurano (circa 5 minuti).
nota: L'intervento dura circa 5-10 minuti.
4. Infusioni di Aβo in ratti svegli e che si muovono liberamente
- Preparare la soluzione di Aβo (0,2 μg/μl). Lasciare che Aβo si aggreghi dinamicamente e spontaneamente per 1 ora a temperatura ambiente prima dell'infusione.
- Installare due siringhe da 10 μl su una pompa per infusione. Riempire le siringhe con 5 μl di acqua distillata sterile. Tagliare due cateteri PE50 a circa 60 cm di lunghezza con un bisturi. Riempire entrambi i cateteri con acqua distillata sterile utilizzando siringhe da 1 ml e aghi da 21 G.
- Tenere le siringhe da 1 ml a un'estremità del catetere e collegare l'altra estremità alle siringhe di Hamilton. Rimuovere le siringhe da 1 ml e verificare che non vi siano bolle d'aria all'interno dei cateteri.
- Inserire la cannula interna all'estremità dei cateteri PE50. Utilizzando acqua distillata sterile, riempire la cannula interna collegata ai cateteri PE50 fino a 1 μl su siringhe Hamilton. Creare una bolla d'aria tirando indietro i pistoni fino a 2 μl.
- Miscelare la soluzione Aβo pipettando su e giù utilizzando un puntale di minima aderenza. Evitare la formazione di bolle durante la miscelazione. Riempire entrambe le cannule interne con 1,5 μl di soluzione di Aβo tirando indietro i pistoni fino a 3,5 μl.
- Tracciare linee con un pennarello prima e dopo la bolla d'aria in entrambi i cateteri. Questo serve come punto di controllo per l'infusione in corso. Per l'infusione, avvicinare la gabbia alla pompa di infusione e rimuoverne il coperchio.
- Metti il topo in una coccola e raschia strettamente il braccio della coccola intorno al collo per immobilizzare la testa del topo. Rimuovere la cannula cieca dalle due cannule guida. Inserire la cannula interna precedentemente preparata nella cannula guida. Verificare che siano completamente inseriti e ben fissati alla base della cannula guida.
- Libera il topo dalle coccole e rimettilo nella sua gabbia per limitare lo stress da contesa. Monitorare attentamente per assicurarsi che i cateteri non si attorciglino insieme e che l'infusione sia eseguita correttamente.
- Accendere la pompa di infusione. Iniettare 1 μl di soluzione di Aβo a una velocità di 0,1 μl/min (10 min). Durante l'infusione, verificare che il pistone della siringa si muova da 3,5 μl a 2,5 μl e che la bolla d'aria in entrambi i cateteri PE50 si muova continuamente.
- Lasciare la cannula interna in posizione per altri 5 minuti dopo l'infusione per consentire una diffusione efficiente della soluzione di Aβo. Riportare il ratto nella coccola per rimuovere la cannula interna e la cannula guida con tappo per prevenire il reflusso della soluzione iniettata. Utilizzare una cannula fittizia che si fermi appena prima del braccio angolare della cannula. Rimetti l'animale nella sua gabbia.
- Ripetere l'infusione di Aβo una volta al giorno per 6 giorni consecutivi. Eutanasia dell'animale mediante decapitazione.
