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1. Fabbricazione e funzionalizzazione di immunosonde capacitive
- Tagliare una lunghezza di 25 cm di filo di platino rivestito di perfluoroalcossi (PFA) (vedere la Tabella dei materiali) e rimuovere circa 5 mm di rivestimento in PFA da un'estremità utilizzando un bisturi, facendo attenzione a non tagliare il filo di platino.
- Inserire l'estremità spelata del filo di platino in un pin del connettore maschio da 1 mm placcato in oro e crimpare i denti del pin del connettore attorno all'estremità spelata del filo di platino utilizzando una pinza ad ago (vedere la tabella dei materiali).
- Saldare il filo di platino al pin del connettore placcato in oro. Fare attenzione a non utilizzare una quantità eccessiva di saldatura.
- Preparare la soluzione di dopamina sciogliendo 50 mg di dopamina HCl in 50 mL di soluzione salina tamponata con fosfato da 10 mM (PBS, pH 6,0) agitando.
- Una volta che la dopamina è completamente dissolta, posizionare la punta del filo di platino nel recipiente contenente il PBS appena integrato con dopamina. Inserire un pin del connettore dorato in un canale dell'headstage (vedi Tabella dei materiali).
- Collegare l'elettrodo a disco in cloruro d'argento (AgCl) (elettrodo di terra, vedere la Tabella dei materiali) al canale di terra nell'headstage. Posizionare il disco AgCl nel recipiente contenente PBS integrato con dopamina e filo di platino; Fare attenzione solo a immergere l'elettrodo a disco e non qualsiasi lunghezza del filo o della saldatura. Collegare uno shunt di filo nei canali di riferimento dell'headstage prima di procedere.
- Aprire il software di acquisizione dati interattivo (vedi Tabella dei materiali). Preparare un protocollo di potenziale di comando per elettrodeposizione a dente di sega con i seguenti parametri: potenziale di avviamento = −0,6 V; potenziale finale = +0,65 V; velocità di scansione = 0,04 V∙s-1; durata della deposizione = 420 s. Iniziare il protocollo di deposizione di polidopamina, assicurandosi che tutti i fili siano collegati correttamente.
- Dopo aver completato la deposizione di polidopamina, rimuovere il pellet macinato AgCl e la punta del filo di platino dal recipiente, facendo attenzione a non disturbare la punta dell'elettrodo a filo di platino. Posizionare la punta del filo in una microprovetta contenente PBS (pH 7,4) per 2-5 minuti mentre la soluzione anticorpale viene preparata; Assicurarsi che la punta del filo non tocchi i lati o il fondo del microtubo.
NOTA: La soluzione anticorpale può essere prodotta durante la deposizione di polidopamina; tuttavia, il trasferimento del filo di platino dal recipiente contenente dopamina al microtubo di PBS dopo la deposizione di polidopamina non deve essere saltato.
- Preparare la soluzione anticorpale. Combinare l'anticorpo di interesse con PBS (pH 7,4) in un rapporto 1:20 in un recipiente di dimensioni adeguate (ad esempio, un microtubo).
NOTA: L'anticorpo monoclonale anti-neuropeptide Y (anti-NPY) (vedi Tabella dei materiali) qui utilizzato è stato aliquotato a 1 mg/mL; un esempio di preparazione di anticorpi in questo caso potrebbe essere 4 μL di anticorpi contro 76 μL di PBS.
- Immergere la punta dell'elettrodo di platino depositata con polidopamina in una soluzione di anticorpi per almeno 2 ore a temperatura ambiente, assicurandosi ancora una volta che la punta del filo di platino sia sospesa nella soluzione e non poggi sulla superficie interna del microtubo.
NOTA: La recente implementazione di questa tecnica ha favorito l'uso dell'elettrodo a filo di platino immediatamente dopo questo passaggio invece della conservazione a umido o a secco per un uso successivo.
- Dopo l'immersione nella soluzione anticorpale, sciacquare brevemente la punta dell'immunosonda capacitiva (sonda CI) appena funzionalizzata in PBS (pH 7,4). La sonda è ora pronta per l'uso.
2. Configurazione sperimentale per il rilevamento e la misurazione in vitro di peptidi
- Posizionare la punta funzionale della sonda CI nella camera di flusso, facendo attenzione a non disturbare in alcun modo la punta dell'elettrodo, poiché ciò potrebbe danneggiare la punta sensoriale della sonda.
NOTA: La camera di flusso è stata creata versando un elastomero siliconico (vedi Tabella dei materiali) in una piastra di coltura da 35 mm con un riempitivo di spazio ovoidale allungato al centro della capsula. Dopo l'indurimento, la forma ovoidale viene rimossa dall'elastomero. La camera viene quindi superfusa con soluzione salina tamponata con Tris (TBS) e consente una velocità di flusso di 3 mL/min. Assicurarsi che l'afflusso e il deflusso mantengano il livello del fluido nella camera in modo tale che non si osservi l'azione di marea del superfusato. Il flusso deve rimanere in posizione per tutto il tempo in cui la sonda CI è in uso.
- Prima del primo test sperimentale, eseguire un'esecuzione standard TBS per condizionare la sonda CI. Impostare il seguente protocollo di tensione di comando: potenziale di gradino positivo = +100 mV; potenziale di gradino negativo = −5 mV; durata del passo = 20 ms; Durata dell'acquisizione = 600 s.
NOTA: È importante consentire l'equilibrio della sonda durante la fase iniziale del potenziale di comando ciclico prima dell'acquisizione dei dati.
- Creare una soluzione del peptide di interesse utilizzando lo stesso TBS per mantenere la composizione del superfusato. Impostare un sistema di collettori in cui il superfusato può essere commutato tra TBS e TBS integrato con peptidi senza introdurre bolle nel sistema di tubi o nella camera di flusso.
NOTA: Nel presente studio è stato utilizzato il peptide NPY suino sintetico (vedi Tabella dei materiali).
- Impostare il protocollo di acquisizione dati con rilevamento dei peptidi utilizzando i parametri standard TBS (vedere il passaggio 2.2.).
NOTA: In questa implementazione, la durata di ogni test sperimentale è stata di 360 s (120 s TBS, 120 s TBS integrato con peptidi, 120 s TBS).