1. Preparazione prima dell'etichettatura
- Preparazione e mantenimento di colture ippocampali primarie
- Preparare colture ippocampali primarie a una densità di 150.000 cellule piastrate su occhiali di copertura da 18 mm rivestiti di poli-D-lisina (0,1 mg/mL). Sono disponibili eccellenti guide per la preparazione di colture neuronali dissociate.
nota: Se necessario, le colture possono essere trattate con citosina arabinoside (Ara-C, 10 μM da giorni in vitro 1 [DIV1]) per evitare la proliferazione gliale nel preparato.
nota: Al posto della poli-D-lisina possono essere utilizzati reagenti di rivestimento alternativi come la fibronectina (1 mg/mL) o la laminina (5 μg/mL).
- Mantenere le colture in un incubatore cellulare a 37 °C e 5% di CO2 in 2 mL/pozzetto di terreno neurobasale integrato con B27 e 2 mM di L-glutammina.
nota: Se lo si desidera, è possibile utilizzare sostituti della L-glutammina (ad es. Glutamax).
- Su base settimanale, rimuovere metà del volume di terreno e sostituirlo con lo stesso volume di terreno neurobasale integrato.
- OPZIONALE: Trasfezione di recettori mutati e/o marcati con epitopi
NOTA: I neuroni devono essere trasfettati almeno 3-4 giorni prima del momento dell'analisi per consentire l'espressione del recettore. L'uso di neuroni giovani (DIV6-9) si traduce in una migliore efficienza di trasfezione rispetto ai neuroni più vecchi (DIV15-20), ma un numero sufficiente di cellule trasfettate (>20) può essere raggiunto indipendentemente dal DIV impiegato.
- Per ogni pozzetto di una piastra a 12 pozzetti, diluire 1,5 μg di plasmide contenente il costrutto di interesse in 100 μL di terreno neurobasale fresco senza integrazione di B27 o glutammina in una provetta per microcentrifuga e mescolare agitando rapidamente.
nota: Per una trasfezione di successo, è fondamentale che il terreno neurobasale utilizzato sia il più fresco possibile, idealmente meno di 1 settimana dopo l'apertura del flacone.
- In una seconda provetta da microcentrifuga, mescolare 1 μL di un reagente di lipofezione appropriato in 100 μL di terreno neurobasale fresco e mescolare delicatamente.
nota: Non agitare la miscela di reagenti per lipofezione. L'uso di reagenti freschi per la lipofezione può migliorare l'efficienza della trasfezione.
- Incubare le provette per 5 minuti a temperatura ambiente (RT).
- Aggiungere la miscela di reagenti di lipofezione goccia a goccia alla miscela di DNA, mescolare delicatamente e incubare per 20 minuti a RT.
- Regolare il volume del terreno in ciascun pozzetto su 1 mL di terreno condizionato.
- Aggiungere il reagente di lipofezione-miscela di DNA goccia a goccia nel pozzetto.
- Riportare le cellule nell'incubatore e attendere almeno 3-4 giorni per l'espressione proteica.
nota: Ai fini dei protocolli di internalizzazione e riciclo descritti di seguito, i neuroni dell'ippocampo sono stati trasfettati a DIV11-12 con costrutti che esprimono GluN2B marcati con proteina fluorescente verde (GFP) nel dominio extracellulare (GFP-GluN2B) e visualizzati a DIV15-16.
- OPZIONALE: Incubazione di cellule con farmaci (cronicamente o acutamente) nel terreno condizionato fino alla fissazione.
NOTA: Per il trattamento acuto, iniziare a trattare le cellule prima della marcatura. A seconda del protocollo di trattamento farmacologico utilizzato, le cellule possono essere mantenute in terreni contenenti farmaco durante la sezione 2. Nel nostro esempio, le cellule DIV21 sono state sottoposte a un protocollo di potenziamento a lungo termine indotto chimicamente (cLTP) per aumentare il recettore dell'acido α-ammino-3-idrossi-5-metil-4-isossazolopionico (AMPAR) espresso in superficie.
- Scambiare terreni condizionati con soluzione extracellulare (ECS).
- Trattare le cellule con 300 μM di glicina nel SEC per 3 minuti a RT. Come controllo, trattare un vetrino coprioggetti gemello con ECS (senza glicina).
- Lavare le cellule 3 volte con ECS a 37 °C e rimettere le cellule in ECS (senza glicina) nell'incubatore cellulare per 20 minuti prima di continuare con la sezione 2.
NOTA: ECS (in mM): 150 NaCl, 2 CaCl2, 5 KCl, 10 acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfonico (HEPES), 30 glucosio, 0,001 tetrodotossina (TTX), 0,01 stricnina e 0,03 picrotossina a pH 7,4.
2. Marcatura in tempo reale dei recettori espressi in superficie
- Preparare i vetrini coprioggetti per l'etichettatura
- Per risparmiare i reagenti e facilitare la manipolazione, trasferire i vetrini coprioggetti con la cella rivolta verso l'alto su un vassoio coperto di film di paraffina.
NOTA: È fondamentale non lasciare mai che i campioni si secchino.
- Conservare e mantenere il terreno condizionato a 37 °C per le fasi di incubazione e lavaggio.
nota: Per un vetrino coprioggetti da 18 mm, si consiglia l'incubazione con 75-100 μl di terreno per la marcatura degli anticorpi e 120-150 μl per l'internalizzazione/riciclaggio.
- Marcatura dei recettori di superficie con anticorpi primari
- Incubare le cellule con l'anticorpo primario diluito in terreno condizionato per 15 minuti a RT.
nota: Per i recettori marcati con GFP, è stato utilizzato l'anticorpo anti-GFP di coniglio con una diluizione di 1:1000. Per il GluA1 endogeno è stato utilizzato l'anti-GluA1 di topo con una diluizione di 1:200.
- Aspirare con cautela il terreno contenente anticorpi utilizzando una pipetta sottovuoto e lavare le cellule tre volte con terreno condizionato.
nota: Se il terreno condizionato non è disponibile, tutte le fasi di lavaggio possono essere eseguite utilizzando PBS+ [soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) contenente 1 mM di MgCl2 e 0,1 mM di CaCl2]. L'aspirazione manuale con micropipetta può essere eseguita se non è disponibile un'aspirazione delicata a vuoto.
3. Espressione di superficie (Figura 1)
- Marcatura secondaria di recettori espressi in superficie
- Lavare una volta con PBS+.
- Fissare le cellule incubando con il 4% di paraformaldeide (PFA) e il 4% di saccarosio in PBS per 7-8 min.
nota: A differenza di altri metodi di fissazione come l'incubazione del metanolo, il PFA non permeabilizza la membrana plasmatica ed è quindi adatto per l'analisi dell'espressione superficiale. Per risultati ottimali, utilizzare PFA appena preparato. La conservazione a breve termine di PFA a 4 °C o la conservazione a lungo termine (fino a 30 giorni) a -20 °C è permissiva per un'adeguata fissazione.
cautela: Il PFA è un noto cancerogeno. Utilizzare dispositivi di protezione individuale adeguati e un cappuccio di sicurezza durante la manipolazione.
- Lavare le celle tre volte con PBS.
nota: In alternativa, la glicina 0,1 M può essere utilizzata per il lavaggio del PFA al posto del PBS, poiché la glicina estinguerà qualsiasi fissativo rimanente che potrebbe aumentare lo sfondo nella preparazione.
- Bloccare i siti di legame aspecifici incubando con il 10% di siero normale di capra (NGS) in PBS per 30 minuti a RT.
nota: Il tempo di blocco può essere prolungato senza effetti negativi sull'etichettatura.
- Incubare con anticorpo secondario marcato in fluorescenza diluito in NGS al 3% in PBS per 1 ora a RT per marcare i recettori primari marcati con anticorpi (cioè espressi in superficie).
nota: In questi esempi, è stata utilizzata una diluizione 1:500 di anticorpi secondari coniugati con Alexa 555: capra anti-coniglio per i recettori marcati con GFP e capra anti-topo per GluA1.
- Celle di lavaggio con PBS 3x.
- Marcatura dei recettori intracellulari
- Permeabilizzare le cellule con Triton X-100 allo 0,25% in PBS per 5-10 minuti a RT.
nota: Per verificare che il ciclo iniziale di marcatura degli anticorpi occupi tutti gli epitopi di superficie, questa fase di permeabilizzazione può essere saltata in una coltura sorella. In questo caso, non dovrebbe essere ottenuto alcun segnale per i recettori intracellulari. Inoltre, per verificare che nessun recettore interno sia stato marcato nella precedente sezione 2 (cioè che mostri l'integrità delle membrane plasmatiche in coltura), la fase di permeabilizzazione può essere saltata in una coltura sorella e un anticorpo primario contro una proteina intracellulare (ad esempio, la proteina di densità postsinaptica 95 [PSD-95] o la proteina 2 associata ai microtubuli [MAP2]) può essere utilizzato nella fase 2.2.1. In queste condizioni, non si dovrebbe ottenere alcun segnale da questo primario. In questo caso, è stato utilizzato un anticorpo anti-PSD-95 di coniglio (1:500).
- Blocca con il 10% di NGS in PBS per 30 minuti a RT.
- Marcare i recettori intracellulari incubando le cellule permeabilizzate con lo stesso anticorpo primario utilizzato nella sezione 2.2 diluito in NGS al 3% in PBS per 1 ora a RT.
nota: La diluizione degli anticorpi per la marcatura dei recettori intracellulari può essere diversa da quella richiesta per la marcatura dei recettori espressi in superficie. Nell'esempio di GluA1 è stata utilizzata la stessa diluizione dell'anticorpo (1:200).
- Lavare le celle 3 volte con PBS.
- Etichetta con secondo anticorpo secondario marcato in fluorescenza diluito in NGS al 3% in PBS per 1 ora a RT.
nota: In questi esempi, è stata utilizzata una diluizione 1:500 dell'anticorpo secondario coniugato Alexa 647 anti-topo di capra (per GluA1).
- Lavare le celle 3 volte con PBS.
4. Interiorizzazione (Figura 2)
- Internalizzazione di recettori di superficie marcati con anticorpi
- Dopo la marcatura dei recettori espressi in superficie e il lavaggio degli anticorpi (sezione 2.2), mantenere le cellule in terreni condizionati senza anticorpi e rimetterle nell'incubatore (37 °C) per consentire l'internalizzazione.
NOTA: Per i recettori N-metil-D-aspartato (NMDA), si raccomandano 30 minuti per l'internalizzazione. Come controllo, una coltura sorella può essere mantenuta con terreni condizionati a 4 °C durante il processo di internalizzazione. In queste condizioni dovrebbe verificarsi un'internalizzazione minima del recettore.
- Marcatura dei recettori di superficie
- Lavare le celle una volta con PBS+.
- Fissare le cellule con il 4% di PFA e il 4% di saccarosio in PBS per 7-8 min.
cautela: Utilizzare dispositivi di protezione individuale adeguati e un cappuccio di sicurezza quando si maneggia il PFA.
- Lavare le celle 3 volte con PBS regolare.
- Bloccare con il 10% di NGS in PBS per 30 minuti a RT per evitare legami non specifici.
- Incubare i campioni con anticorpi secondari marcati in fluorescenza diluiti in NGS al 3% in PBS per 1 ora a RT per marcare i recettori primari marcati con anticorpi (cioè i recettori espressi in superficie che non sono stati internalizzati).
nota: Per questo esempio, per l'etichettatura è stato utilizzato l'anticorpo secondario anti-coniglio di capra coniugato con Alexa 555 (1:500).
- Lavare le celle 3 volte con PBS.
- Marcatura di recettori internalizzati
- Permeabilizzare le cellule con Triton X-100 allo 0,25% in PBS per 5-10 minuti.
- Bloccare il legame aspecifico mediante incubazione con il 10% di NGS in PBS per 30 minuti a RT.
- Incubare i campioni con anticorpi secondari marcati in fluorescenza diluiti in NGS al 3% in PBS per 1 ora a RT per marcare i recettori marcati con anticorpi internalizzati.
nota: Per questo esempio, per l'etichettatura viene utilizzato l'anticorpo secondario anti-coniglio di capra coniugato Alexa 647 (1:500).
- Lavare le celle 3 volte con PBS.
5. Riciclaggio (Figura 3)
- Internalizzazione di recettori di superficie marcati con anticorpi
- Dopo la marcatura dei recettori espressi in superficie e il lavaggio degli anticorpi (sezione 2.2), mantenere le cellule in terreni condizionati senza anticorpi e rimetterle nell'incubatore (37 °C) per consentire l'internalizzazione.
NOTA: Per i recettori NMDA, si consigliano 30 minuti per l'internalizzazione.
- Blocco dei recettori espressi in superficie stabile
- Per bloccare gli epitopi sull'anticorpo primario attaccato ai recettori espressi in superficie che non sono stati internalizzati, incubare le cellule con frammenti di anticorpi Fab anti-IgG (H+L) non coniugati (contro il primario utilizzato nella sezione 2.2) diluiti in terreno condizionato (20 μg/mL) per 20 minuti a RT. Questo trattamento previene l'interazione futura con gli anticorpi secondari.
nota: Per questo esempio, sono stati utilizzati frammenti Fab anti-coniglio di capra.
nota: Esperimento di controllo: per garantire che si sia verificato il blocco completo dei recettori espressi in superficie, i vetrini coprioggetti fratelli possono essere incubati con e senza Fab. Le colture devono essere fissate immediatamente dopo il trattamento Fab ed entrambe le colture vengono incubate con l'anticorpo secondario coniugato con Alexa 555. L'assenza di segnale Alexa 555 nelle cellule incubate da Fab indica un corretto blocco degli anticorpi.
- Lavare le celle 3 volte con fluido condizionato.
- Incubare le cellule con terreni condizionati contenenti 80 μM di dinasoro per prevenire un'ulteriore internalizzazione e riportare le cellule nell'incubatore (37 °C) per consentire il riciclo dei recettori internalizzati. Il dinasoro è un inibitore della GTPasi che inibisce la dinamina e quindi ne impedisce l'internalizzazione.
NOTA: Si consiglia di utilizzare 45 minuti per il riciclo NMDAR. Si noti che Dynasore blocca esclusivamente il processo di internalizzazione dinamina-dipendente (ad esempio, l'internalizzazione degli NMDAR). Tuttavia, l'internalizzazione di altre proteine sinaptiche (dinamina-indipendente) può ancora verificarsi in presenza di dinasorio.
- Etichettatura dei recettori riciclati
- Lavare le celle una volta con PBS+.
- Fissare le cellule con il 4% di PFA e il 4% di saccarosio in PBS per 7-8 min.
cautela: Utilizzare dispositivi di protezione individuale adeguati e un cappuccio di sicurezza quando si maneggia il PFA.
- Lavare le celle 3 volte con PBS.
- Bloccare con il 10% di NGS in PBS per 30 minuti a RT per evitare legami non specifici.
- Cellule marcate con il primo anticorpo secondario marcato in fluorescenza diluito in NGS al 3% in PBS per 1 ora a RT.
nota: Per questo esempio, per l'etichettatura è stato utilizzato l'anticorpo anti-coniglio di capra coniugato con Alexa 555 (1:500).
- Celle di lavaggio 3x con PBS.
nota: Lavaggi più lunghi con PBS (5-10 minuti) possono aiutare a ridurre lo sfondo nella preparazione.
- Marcatura di recettori internalizzati
- Permeabilizzare le cellule con Triton X-100 allo 0,25% in PBS per 5-10 minuti.
- Blocca con il 10% di NGS in PBS per 30 minuti a RT.
- Etichetta con secondo anticorpo secondario marcato in fluorescenza diluito in NGS al 3% in PBS per 1 ora a RT.
nota: Per questo esempio, per l'etichettatura è stato utilizzato l'anticorpo anti-coniglio di capra coniugato Alexa 647 (1:500).
- Lavare le celle 3 volte con PBS.
6. Montaggio e imaging dei campioni
- Montare le celle posizionando delicatamente i vetrini coprioggetti con il lato rivolto verso il basso su 12-15 μl del mezzo di montaggio appropriato.
nota: L'aspirazione di supporti di montaggio in eccesso migliorerà la qualità delle immagini.
- Immagine delle cellule su un microscopio confocale appropriato.
nota: Si consiglia di visualizzare uno z-stack con un ingrandimento di 60x con incrementi di 0,35 μm, che comprende l'intero spessore del neurone.
7. Considerazioni sul tempo
- Si tratta di un protocollo lungo che può essere interrotto in diversi punti. Se lo si desidera, eseguire le fasi di blocco e di incubazione degli anticorpi primari durante la notte a 4 °C in una camera umida.
- In alternativa, se lo si desidera, utilizzare un processatore di tessuti a microonde per accelerare notevolmente i tempi di incubazione post-fissazione. Per tutte le fasi, utilizzare 150 W a 30 °C per le impostazioni "On".
- Per bloccare, far funzionare il processore a 2 minuti su "On", 1 min su "Off" e 2 min su "On".
- Per le fasi di incubazione degli anticorpi primari e secondari, far funzionare il processore a 3 minuti "On", 2 min "Off" e 3 min "On"
NOTA: Non rileviamo alcuna differenza di qualità apportando le modifiche di cui sopra al protocollo.
8. Analisi delle immagini
- Si consiglia di utilizzare FIJI per condurre l'analisi delle immagini, poiché è compatibile con più formati di file. Per i nostri dati, sono state acquisite immagini nel formato di file Nikon ND2.
- Viene fornito uno script macro per una facile quantificazione in batch di diversi parametri preselezionati dalle FIJI. I seguenti passaggi sono inclusi nella macro:
NOTA: Per questi esempi, è stata misurata l'"intensità integrata".
- Apri i file immagine in FIJI e separa i canali.
- Z proietta ogni stack di canali come proiezione di massima intensità.
- Impostare una soglia inferiore per ciascun canale.
NOTA: Le soglie devono essere determinate empiricamente per ogni set di dati sperimentali. Sebbene ogni canale possa avere un valore di soglia inferiore separato, è fondamentale che i valori di soglia del canale vengano mantenuti in modo coerente per tutte le immagini dello stesso set di dati.
- Seleziona da tre a cinque dendriti secondari o terziari e salvali come regioni di interesse (ROI).
- Misura la densità integrata di ciascun ROI nei canali superficiali e intracellulari.
- Normalizza il segnale per ogni ROI dividendo il valore di densità integrato del canale di superficie per il canale intracellulare.
- Ripetere le misurazioni per tutte le immagini di controllo e sperimentali e normalizzare i valori sperimentali per controllare i valori (ad esempio, GluN2B WT o condizioni di assenza di glicina).
