È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Una tecnica in vitro per studiare il traffico del recettore del glutammato nei neuroni dell'ippocampo

736 visualizzazioni

8 luglio 2025

In questo articolo

Abstract

Fonte: Chiu, A. M., et al. Un approccio all'alimentazione degli anticorpi per studiare il traffico del recettore del glutammato in colture primarie dissociate dell'ippocampo. J. Vis. Exp. (2019)

Questo video dimostra un approccio di alimentazione anticorpale per studiare il traffico dei recettori del glutammato nelle colture neuronali primarie dell'ippocampo. Questo approccio consente l'osservazione delle popolazioni di recettori sia nel plasma che nelle membrane interne. La discriminazione tra questi sottogruppi si ottiene marcando i recettori prima e dopo la permeabilizzazione della membrana, utilizzando lo stesso anticorpo primario ma anticorpi secondari coniugati a diversi fluorofori.

Protocollo

1. Preparazione prima dell'etichettatura

  1. Preparazione e mantenimento di colture ippocampali primarie
    1. Preparare colture ippocampali primarie a una densità di 150.000 cellule piastrate su occhiali di copertura da 18 mm rivestiti di poli-D-lisina (0,1 mg/mL). Sono disponibili eccellenti guide per la preparazione di colture neuronali dissociate.
      nota: Se necessario, le colture possono essere trattate con citosina arabinoside (Ara-C, 10 μM da giorni in vitro 1 [DIV1]) per evitare la proliferazione gliale nel preparato.
      nota: Al posto della poli-D-lisina possono esser....

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

figure-results-1
Figura 1: cLTP aumenta l'espressione superficiale di GluA1. I neuroni primari dell'ippocampo a DIV21 sono stati sottoposti a LTP chimico (cLTP) mediante incubazione con ECS contenente glicina. La distinta etichettatura delle popolazioni di GluA1 espresse in superficie (rosso) rispetto a quelle intracellulari (blu) rivela l'atteso aumento dell'espressione di superficie di AMPAR. (A) I.......

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Vetri coprioggetti spessi #1,5 mm di diametroNeuvitroGG181.5
Alexa 555-capra coniugata anti-topo secondarioTecnologie per la vitaCodice A21424
Alexa 555-capra coniugata anti-coniglio secondariaTecnologie per la vitaCodice A21429
Alexa 647-capra coniugata anti-topo secondarioTecnologie per la vitaCodice A21236
Alexa 647-capra coniugata anti-coniglio secondariaTecnologie per la vitaCodice A21245
B27Gibco17504044
CaCl2sigmaVisualizzazione del materiale C7902
Piastre per colture cellulari a fondo piatto Corning CostarCorning3513
DinasoroTocrisCodice: 2897
glucosiosigmaG8270
glicinaTocris219
Capra anti-coniglio Fab frammentisigmaSAB3700970
HEPESsigmaH7006
KclsigmaP9541
L-GlutamminasigmaG7513
Lipofectamina 2000Invitrogen11668019
Anticorpo anti-GluA1 del topoMilliporeMAB2263
NaClsigmaS6546
Media neurobasaleGibco21103049
Rete NGSAbcamCodice: Ab7481
ParafilmBemisPM999
PbsGibco10010023
Pelco BioWaveTed Pella36500
PFAAlfa AesarNumero 43368
PicrotossinaTocrisOre 1128
Bromidrato di poli-D-lisinasigmaP7280
ProLong Montante Oro AntisbiadimentoTecnologie per la vitaP36934
Anticorpo anti-GFP di coniglioInvitrogenCodice: A11122
Anticorpo anti-PSD-95 di coniglioSegnalazione cellulareAnno 2507
stricninaTocrisCodice: 2785
saccarosiosigmaS0389
Vetrini per microscopio Superfrost pluspescatore12-550-15
Triton X-100sigmaX100
TTXTocrisCodice: 1078

Tag

Approccio di alimentazione con anticorpimarcatura dei recettori di superficieendocitosi dei recettoririciclo dei recettorimicroscopia confocaleanticorpi secondari marcati con fluoroforopermeabilizzazione di membranalegame dell'anticorpo primario