Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Preparazione della microsfera target
- Selezionare un antigene target pertinente.
nota: In questo esempio, è stata utilizzata la proteina ricombinante V1V2-2F5K, che è stata progettata per imitare l'apice trimerico dell'involucro nativo dell'HIV.
- Eseguire la biotinilazione utilizzando un kit commerciale (Tabella dei materiali) secondo il protocollo del produttore.
- Calcolare mmol del reagente di biotina da aggiungere alla reazione per un eccesso molare di 5 volte utilizzando la formula: mmol di biotina = mL di proteina x (mg di proteine/mL di proteine) x (mmol di biotina/mg di proteine) x (5 mmol di biotina/mmol di proteine). Quindi calcolare μL del reagente di biotina da aggiungere utilizzando la formula: μL di biotina = mmol di biotina x (1.000.000 μL/L) x (L/10 mmol).
- Equilibrare la biotina a temperatura ambiente prima dell'apertura. Sciogliere le proteine in 0,5-2,0 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) secondo il calcolo effettuato sopra.
- Preparare una soluzione da 10 mM di reagente di biotina in dimetilsolfossido (DMSO) e aggiungere il volume appropriato di 10 mM di reagente di biotina alla soluzione proteica e incubare la reazione su ghiaccio per 2 ore o a temperatura ambiente per 30 minuti.
- Rimuovere la biotina in eccesso utilizzando concentratori di proteine (membrane in polietersulfone [PES], cut-off del peso molecolare di 3 kDa [MWCO], 0,5 mL; Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore.
- Depositare il campione nella camera superiore della colonna di centrifuga e aggiungere PBS fino a 400 μl. Tappo, quindi inserire questa camera del campione in una provetta di raccolta. Centrifugare a 12.000 x g a temperatura ambiente per 30 min.
- Scartare il flusso continuo e aggiungere PBS a 400 μL. Ripetere la centrifugazione. Scartare il flusso continuo e aggiungere PBS a 100 μL. Misurare la concentrazione di proteine con uno spettrofotometro.
nota: Le proteine possono essere aliquotate e congelate a -80 °C fino al momento dell'utilizzo.
2. Preparazione della piastra per il test di fagocitosi cellulare anticorpo-dipendente (ADCP)
- Coniugare la proteina biotinilata in microsfere da 1 μm ('beads'; Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore.
- Per piastra di perle coniugate, incubare 6 μg di proteine con 12 μL di perle madre in 200 μL di albumina sierica bovina (BSA)-PBS allo 0,1% a temperatura ambiente per 1 ora, agitando delicatamente ogni 20 minuti.
- Centrifugare a 13.000 x g per 5 min. Scartare il surnatante, agitare delicatamente e risospendere in 1200 μL di BSA-PBS allo 0,1%. Ripetere il passaggio di centrifuga e lavaggio 2 volte. Risospensione in 1200 μL di BSA-PBS allo 0,1%.
- Aliquotare 10 μl di soluzione di perline per pozzetto in una piastra a fondo rotondo a 96 pozzetti. Preparare diluizioni di anticorpi o sieri immunitari di interesse in 12 μL di HSA HBSS al 2%, in genere a partire da 50 μg/mL di anticorpo o una diluizione sierica di 1/100.
nota: Nei dati del campione è stato utilizzato l'anticorpo monoclonale (mAb) 830A.
- Aggiungere 10 μl di anticorpo/siero titolato alla piastra del microscino e incubare per 2 ore a 37 °C. Aggiungere 200 μl di HSA HBSS al 2% in ciascun pozzetto e centrifugare la piastra a 2.000 x g per 10 minuti.
- Rimuovere con cura il surnatante ribaltando e travasando rapidamente il liquido dai pozzetti della piastra in un lavandino per evitare di disturbare il pallino invisibile.
3. Isolamento delle cellule del latte materno
- Ottenere latte materno umano da donne sane che allattano, estratto utilizzando doppi tiralatte elettronici o manuali. Isolare le cellule entro ~4 ore dall'espressione, mantenendo il latte a temperatura ambiente.
- Utilizzando provette da 50 mL, centrifugare 50 mL di latte a 800 x g per 15 min. Versare con cura il latte scremato e il grasso lasciando inalterato il pellet cellulare. Pulire l'interno del tubo con un panno privo di lanugine per rimuovere tutto il grasso dalla parete del tubo.
- Aggiungere 10 mL di albume sierico umano al 2% nella soluzione salina bilanciata di Hank (2% HSA HBSS [senza Ca2+ o Mg+]). Risospendere il pellet mediante pipettaggio delicato per evitare l'attivazione cellulare e l'apoptosi. Trasferire in una provetta da 15 mL e centrifugare a 450 x g per 10 min.
- Versare il surnatante e ripetere il passaggio 1.3. Quindi, risospendere delicatamente le cellule in 1-2 mL di HSA HBSS al 2% a seconda del numero di cellule previsto e contare le cellule con un emocitometro o un contatore di cellule automatizzato, rilevando anche la vitalità cellulare.
4. Saggio ADCP
NOTA: I metodi qui descritti sono adattati da Ackerman et al.
- Aggiungere 50.000 cellule BM appena isolate a ciascun pozzetto della piastra del saggio ADCP in 200 μl di HSA-HBSS al 2%. Incubare per 2 ore a 37 °C.
- Per gli esperimenti di controllo, pre-incubare le cellule a 37 °C con 10 μg/mL di inibitore dell'actina (citocalasina-D), 50 μg/mL di agente bloccante del recettore Fc (FcBlock) o una combinazione di entrambi prima della loro aggiunta alle piastre.
- Centrifugare la piastra a 930 x g per 10 minuti. Aggiungere 200 μl di HSA HBSS al 2% e ripetere la centrifugazione. Rimuovere con cura il surnatante come al punto 2.7 e ripetere il lavaggio.
- Rimuovere con cautela il surnatante e colorare le cellule per verificarne la vitalità utilizzando 0,5 μg/mL (concentrazione finale) di colorazione di vitalità fissabile 450 per pozzetto in 50 μL di HSA HBSS al 2%. Incubare 20 minuti a temperatura ambiente al buio. Centrifugare la piastra a 930 x g per 10 minuti e rimuovere il surnatante come al punto 2.7. Aggiungere 200 μl di HSA HBSS al 2% e centrifugare nuovamente la piastra, seguita dalla rimozione del surnatante come al punto 2.7.
- Dopo la colorazione di vitalità, colorare le cellule per i marcatori leucocitari di interesse, includendo minimamente un colorante specifico per CD45 come il CD45 anti-umano di topo PE (clone HI30) a una concentrazione ottimizzata (1 μg/μL in 50 μL di 1% BSA HBSS nei dati di esempio).
nota: È possibile includere eventuali marcatori di interesse specifici del lignaggio.
- Incubare 20 minuti a temperatura ambiente al buio. Centrifugare la piastra a 930 x g per 10 minuti e rimuovere il surnatante come al punto 2.7. Aggiungere 200 μl di BSA HBSS all'1% e ripetere la centrifugazione. Rimuovere il surnatante. Fissare le celle in 200 μl di formaldeide allo 0,5% al buio a temperatura ambiente per 30 minuti o per una notte a 4 °C. Conservare in frigorifero al buio fino all'analisi.
5. Analisi mediante citometria a flusso
- Eseguire il gating iniziale per eliminare i doppietti su un grafico a dispersione diretta (FSC) rispetto a quella laterale (SSC) e detriti (materiale inferiore a FSC = 5000) (vedere la Figura 1). Utilizzare un grafico SSC vs. vitalità (V450 in questo caso) per eliminare le cellule morte (quelle che sono positive per la colorazione di vitalità).
- Utilizzare un grafico SSC vs. CD45 per differenziare le principali classi di leucociti (granulociti, monociti, linfociti) come ampiamente descritto.
nota: Questa classificazione è solo indicativa e sono necessari marcatori specifici per il lignaggio per confermare il tipo di cellula.
- Per tutte le cellule CD45+, o per ogni sottogruppo di leucociti di interesse, misurare l'attività dell'ADCP mediante gating con un marcatore sulle cellule positive alle perle in un istogramma del canale dell'isotiocianato di fluoresceina (FITC), dove vengono rilevate le perle fluorescenti><.
nota: I pozzetti di controllo negativo in cui non sono state aggiunte le perle indicheranno dove sono evidenti le cellule positive alle perle nell'istogramma e quindi dove posizionare il marcatore di gating.
- Calcolare i punteggi ADCP come (intensità di fluorescenza mediana [MFI] delle cellule bead-positive) x (% delle cellule CD45 + totali nella popolazione positiva). Utilizza il software di grafica per tracciare i punteggi a ciascuna concentrazione di Ab/siero e per eseguire un'analisi dell'area sotto la curva (AUC).
nota: L'ADCP è considerato positivo se l'AUC è maggiore di 3 volte la deviazione standard dell'AUC del punteggio ADCP di un mAb di controllo negativo non specifico (in questo caso, 3865).
