Valutazione dell'afflusso di calcio indotto dal recettore delle cellule T utilizzando un colorante indicatore di calcio

Abstract

Fonte: Perrenoud, L. et al., Analisi dell'afflusso di calcio indotto dal recettore delle cellule T nelle cellule T murine primarie mediante citometria a flusso a spettro completo.J. Vis. Exp. (2022)

Questo video analizza l'afflusso di calcio indotto dal recettore delle cellule T nelle cellule T. Gli anticorpi anti-CD3 attivano le vie di segnalazione delle cellule T, portando ad un aumento degli ioni calcio intracellulari che si legano con il colorante Indo-1. Nella citometria a flusso, uno spostamento dello spettro dallo stato privo di calcio allo stato legato al calcio è correlato all'afflusso di calcio indotto dal recettore delle cellule T.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Preparazione di cellule immunitarie dalla milza del topo

NOTA: Eutanasia di topi ingenui con eutanasia di anidride carbonica (CO₂). I topi C57BL/6 acquistati dai Jackson Laboratories e allevati internamente vengono utilizzati per esperimenti a 6-12 settimane di età. Per gli esperimenti vengono utilizzati sia topi maschi che femmine.

1. Disinfettare la pelle del topo con etanolo al 7....

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastre trattate TC a 12 pozzetti	Cell Treat	229111
50 mL conico	Greiner Bio1	41-12-17-03	Provette da centrifuga in polipropilene da 50 mL con tappo
Provette di flusso in polistirene da 5 ml	Corning	352052
Siringa da 5 ml	Siringa BD	309646	solo lo stantuffo viene utilizzato sheith viene scartato
Filtro 70uM	Greiner bio1	Codice: 542070
aCD3 (17A2)	Bioleggenda	100202
Tampone di lisi AKC	Gibco	A1049201
Citometro a flusso spettrale Aurora	https://cytekbio.com/pages/aurora
Perline da bagno	Coleparmer	Articolo # UX-06274-52
CD19 PE	Tonbo	50-0193-U100
Tetramero CD1d APC	Nih
CD25 PECy7	ebioscience	Codice 15-0251
CD4 APC Cy7	Tonbo	Codice 25-0042-U100
CD8a FITC	ebioscience	11-0081-85
incubatore cellulare	Scientifico formale
Strumenti di dissezione pinza	Mckesson	#487593	Pinze per tessuti McKesson Adson 4-3/4 pollici di lunghezza Acciaio inossidabile non sterile Non bloccante Impugnatura per pollice 1 x 2 denti
Strumenti di dissezione Forbici	Mckesson	#970135	Forbici operative McKesson Argent™ 4-1 / 2 pollici di grado chirurgico in acciaio inossidabile Finger Ring Handle Punta affilata diritta / Punta affilata
DPBS 1x	Gibco	Codice 14190-136	DPBS
EGTA	pescatore	NC1280093
FBS	Hyclond	SH30071.03	lotto AE29165301
Software FlowJo	https://www.flowjo.com/
Colorante estere Indo1-AM	ebioscience	65-085-39	Colorante di caricamento del calcio
Ionomicina	Millipore	407951-1 mg
Fantasma vivo/morto 540	Tonbo	13-0879-T100
Provette per microcentrifuga 1,7mL	Laboratori di luce	A-7001
Penicillina/Streptomicina/L-glutammina	Gibco	Codice 10378-016
PRN694	Med Chem Express	Hy-12688
Anti-topo purificato CD16/CD32 (scudo FC) (2.4G2)	Tonbo	70-0161-M001	Blocco FC
Giri di velocità	Gibco	1875093	+ rosso fenolo
RPMI senza fenolo	Gibco	11835030	-rosso fenolo
Centrifuga da tavolo	Beckman Coulter	Allegra612
TCRβ PerCP Cy5.5	ebioscience	45-5961-82
TCRγ/δ Pe Cy5	ebioscience	Codice 15-5961-82
Confezione di reagenti Vi-Cell Blu		N. prodotto: C06019	Cosa è incluso Tripan
Vi-Cell Blu	Beckman Coulter
Bagno d'acqua	Fisher Brand Bagno secco