Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione di cellule immunitarie dalla milza del topo
NOTA: Eutanasia di topi ingenui con eutanasia di anidride carbonica (CO2). I topi C57BL/6 acquistati dai Jackson Laboratories e allevati internamente vengono utilizzati per esperimenti a 6-12 settimane di età. Per gli esperimenti vengono utilizzati sia topi maschi che femmine.
- Disinfettare la pelle del topo con etanolo al 70% per ridurre la possibilità che contaminanti esterni entrino nel campione.
- Sezionare la milza del topo usando strumenti di dissezione, forbici chirurgiche e pinze. Raccogliere la milza e posizionare la milza staccata in una provetta conica da 50 ml con ~5 ml di terreno completo del Roswell Park Memorial Institute (cRPMI) su ghiaccio.
nota: L'RPMI completo è composto per il 10% da siero fetale bovino (FBS), 2 mM di L-glutammina e per l'1% da penicillina/streptomicina.
- Per raccogliere la milza del topo, praticare un'incisione di 5 cm nel pelo e nella pelle lungo il lato sinistro del topo a metà strada tra le zampe anteriori e posteriori con le forbici. Aprire la cavità corporea di ~5 cm e rimuovere la milza con una pinza. La milza è del colore di un fagiolo ed è più lunga e piatta del rene vicino.
- Versare il contenuto del passaggio 1.2 su un filtro sterile da 70 μm collegato a una nuova provetta conica da 50 mL. Separare meccanicamente la milza in una sospensione unicellulare spingendo la milza attraverso il filtro con uno stantuffo della siringa da 5 ml fino a quando non rimane più polpa di milza sulla superficie del filtro.
- Pellettare gli splenociti utilizzando una centrifuga da banco a rotore oscillante a 500 x g per 5 minuti a 4 °C.
- Decantare accuratamente il surnatante. Gli splenociti pellettati rimangono sul fondo del tubo conico da 50 mL.
- Per rimuovere i globuli rossi, risospendere gli splenociti pellettati in 1 mL di tampone di lisi ammonio-cloruro-potassio (ACK) per 3 minuti secondo le istruzioni del produttore. Mescola bene.
- Spegnere il tampone di lisi ACK con 15 mL di cRPMI.
- Pellettare i linfociti come indicato al punto 1.4.
- Risospendere la sospensione cellulare in 5 mL di cRPMI in una provetta conica da 50 mL. Posizionare i campioni sul ghiaccio.
- Per contare le cellule, trasferire 10 μl di sospensione cellulare in una provetta da microcentrifuga da 0,6 mL e diluire in rapporto 1:1 con la soluzione di blu di tripano. Quindi, trasferire su un emocitometro o su un sistema automatizzato di conteggio delle cellule.
- Dopo aver contato, a seconda della concentrazione di cellule in sospensione cellulare come al punto 1.9, pellettare le cellule in una centrifuga da tavolo a 500 x g a 4 °C per 5 minuti per preparare l'aggiunta di terreni cRMPI contenenti colorante estere Indo-1 AM.
- Calcolare il volume per la risospensione delle cellule per ottenere 10-12 x 106 cellule/mL. Si tratta di una concentrazione 2x della conta cellulare totale richiesta.
- Risospendere le celle nel volume di cRPMI calcolato al punto 1.11. Posizionare le cellule a 37 °C con il 5% di CO2 in una provetta conica da 50 mL con il coperchio ventilato o in una piastra di coltura tissutale.
2. Colorante raziometrico indo-1 e marcatura di anticorpi fluorescenti
- Secondo le istruzioni del produttore, aggiungere 50 μl di dimetilsolfossido (DMSO) in una fiala contenente 50 μg di Indo-1 AM. La concentrazione della soluzione madre è di 1 μg/μL.
nota: Il DMSO viene fornito in micro-fiale con il kit per prevenire qualsiasi ossidazione del DMSO.
- Diluire l'aliquota madre (1 μg/μL) nell'appropriato volume sperimentale (stabilito al punto 1.11) di cRPMI ad una concentrazione di 6 μg/mL, una concentrazione 2x. Non conservare Indo-1 in una soluzione acquosa.
nota: Altri tamponi con aggiunta di calcio possono essere utilizzati a seconda delle esigenze della cellula.
- Mettere da parte il terreno completo con Indo-1 a bagnomaria a 37 °C.
nota: Utilizzare la concentrazione minima di estere Indo-1 AM necessaria per ottenere un segnale adeguato. Questo deve essere titolato per diversi tipi di cellule. In genere, è sufficiente una concentrazione compresa tra 3-5 μM. Per le cellule T primarie, il caricamento delle cellule con Indo-1 a una concentrazione >5 μg/mL aumenta l'intensità media della fluorescenza (MFI) al di sopra di un log di 6 sui citometri a flusso spettrale. In tal caso, diminuire l'intensità del laser ultravioletto (UV) e titolare l'Indo-1 a una concentrazione inferiore.
- Diluire la sospensione cellulare precedentemente preparata (al punto 1.12), 1:1 in cRPMI, compreso il terreno 2x Indo-1 realizzato al passaggio 2.2. Assicurarsi che le celle siano a una concentrazione compresa tra 5-6 x 106/mL.
nota: Non caricare il colorante con il controllo della singola macchia non colorata o i controlli della singola cellula di colorazione del marcatore di superficie con Indo-1. L'aggiunta di Indo-1 ai controlli con anticorpi a colorazione singola creerà un campione multicolore grazie all'aggiunta di Indo-1 a singole cellule colorate. Includere l'acido tetraacetico glicole etilenico indo-1 (privo di calcio) per aggiungere il controllo alla piastra del campione creata al passaggio 2.6.
- Aggiungere 1 mL di cellule/pozzetto/condizione sperimentale in una piastra di coltura tissutale a 12 pozzetti.
- Creare un singolo controllo colorato per il campione Indo-1 (privo di calcio) utilizzando celle precedentemente caricate con colorante Indo-1 e aggiungere EGTA a una concentrazione finale di 2 mM. L'EGTA chela il calcio nella sospensione cellulare, fornendo un campione di controllo più pulito.
- Creare un controllo positivo Indo-1 (Indo-1 legato al calcio) aggiungendo 50 μM di ionomicina alla sospensione cellulare caricata con colorante al citometro a flusso. La ionomicina è uno ionoforo di calcio permeabile alla membrana che lega gli ioni calcio e facilita il trasferimento degli ioni calcio nelle cellule.
- Creare un pozzetto per il controllo biologico negativo senza fluorofori o coloranti Indo-1.
- Creare un pozzetto per i controlli a colorazione singola per eventuali popolazioni cellulari aggiuntive di interesse (anticorpi definiti dall'utente) utilizzando fluorofori coniugati con anticorpi in un pannello di citometria a flusso. Questi non includeranno il colorante raziometrico Indo-1.
- Aggiungere l'anticorpo bloccante il recettore Fc (~2 μg/1 x 106 cellule), secondo le istruzioni del produttore, prima di aggiungere ulteriori anticorpi coniugati con fluorocromo per la colorazione superficiale.
- Incubare la piastra per 45 minuti a 37 °C con CO 2 al 5%.
- Risospendere le cellule in una piastra a 12 pozzetti picchiettando delicatamente la piastra ogni 15 minuti.
- Mescolare e rimuovere l'intero volume di cellule sospese nel terreno dalla piastra a 12 pozzetti. Quindi aggiungere la sospensione cellulare a provette per microcentrifuga da 1,7 mL.
- Pellettare le celle in una microcentrifuga a 500 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Decantare il surnatante e lavare le cellule aggiungendo 1 ml di cRPMI preriscaldato. Pellettare di nuovo e decantare il surnatante.
nota: Il lavaggio delle cellule rimuove gli anticorpi che bloccano le Fc rimanenti.
- Risospendere le cellule in 1 mL di cRPMI in provette da microcentrifuga da 1,7 mL e incubare ciascuna provetta a 37 °C per altri 30 minuti al 5% di CO2, lasciando la parte superiore della provetta leggermente aperta per consentire lo scambio di gas. Ciò consente la completa deesterificazione degli esteri AM intracellulari.
- Se necessario, trasferire nuovamente le cellule in una piastra di coltura tissutale a 12 pozzetti. Ulteriori anticorpi coniugati con fluorocromo titolati definiti dall'utente possono essere aggiunti in una fase di riposo.
nota: I marcatori utilizzati nel pannello dei metodi includono: Ghost 540, CD4, CD8, TCRβ, TCRγδ, CD25 e CD1d/α-galcer tetramero. I marcatori vengono scelti per analizzare i sottoinsiemi di cellule T.
- Creare una miscela master di tutti gli anticorpi coniugati con fluorocromo definiti dall'utente in base ai tipi di cellule di interesse a un volume precedentemente titolato in una provetta per microcentrifuga da 1,7 mL.
- Aggiungere una miscela master calcolata per 1 mL del volume cellulare, dipendente dagli anticorpi titolati contro le cellule a riposo.
nota: Il vantaggio della colorazione al passaggio 2.15 invece del passaggio successivo 2.18 è che la colorazione al passaggio 2.15 ridurrà il tempo di incubazione complessivo per l'esperimento. Tuttavia, la colorazione in un volume totale di 1 mL al passaggio 2.15 aumenta l'utilizzo di anticorpi.
- Dopo il riposo, pellettare le celle a 500 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
nota: Le cellule di una piastra per coltura tissutale a 12 pozzetti possono essere pellettate nella piastra con un accessorio per centrifuga su piastre. In caso contrario, pellettare le cellule in una provetta da microcentrifuga da 1,7 mL.
- Lavare le celle risospendendo il pellet in 1 mL di cRPMI freddo a 4 °C e pellettare nuovamente le cellule come al punto 2.16. Mettere le celle sul ghiaccio.
nota: Se si colorano separatamente le cellule in superficie, dopo la deesterificazione al passaggio 2.18, è necessario un volume di anticorpi inferiore. La colorazione superficiale in questa fase può essere eseguita dopo la fase di riposo in tampone a flusso freddo (1x soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS) con aggiunta dell'1% di FBS), utilizzando anticorpi definiti dall'utente, su ghiaccio per 30 minuti. Lavare le cellule dopo la colorazione in cRPMI come al punto 2.17.
- Aggiungere il colorante di vitalità Ghost540 diluito 1:7.500 in DPBS ai campioni secondo le istruzioni del produttore. Il calore uccide le celle a 55 °C su un blocco riscaldante per il controllo vivo/morto a colorazione singola.
nota: La colorazione funzionale del colorante per eliminare le cellule morte nell'analisi citofluorimetrica viene eseguita senza FBS. FBS può interagire con i coloranti amminici secondo le istruzioni del produttore.
- Risospendere i singoli campioni in 500 μL di cRPMI (privo di rosso fenolo) utilizzando una provetta di flusso in polistirene da 5 mL con tappo.
nota: Le celle possono essere lasciate a 4 °C per un massimo di un'ora.
- Riscaldare ogni provetta da 5 mL contenente cellule, singolarmente, a 37 °C utilizzando un bagno di microsfere per 7 minuti prima dell'analisi sul citometro a flusso, mantenendo un tempo costante tra i campioni. Usa un timer.
3. Tubo da bagno per perline: mantenimento della temperatura durante l'analisi del flusso di calcio
- Aggiungere le perle da bagno a bagnomaria senza aggiunta di acqua; riscaldare fino a 37 °C.
- Tagliare con cura a metà una provetta conica da 50 mL, alla tacca di 25 mL, con una lama di rasoio; scartare la parte superiore della provetta.
- Riempire il tubo dimezzato per 3/4 con le perline da bagno.
- Posizionare il tubo creato al punto 3.2 nel bagno di perline creato al punto 3.1. Portare il tubo e le perline a 37 °C.
- Collegare il bagno di microsfere a una presa elettrica accanto al citometro a flusso per mantenere la temperatura in preparazione per l'analisi del campione.
- Aggiungere un rack conico di polistirolo da 50 ml per contenere una provetta per posizionare la provetta in posizione durante l'esecuzione sul citometro a flusso. In questo modo si elimina la necessità di tenere manualmente il tubo per tutta la durata dell'analisi della curva.
