Un test per quantificare il legame delle VLP del Norovirus umano ai batteri intestinali

Abstract

Fonte: Madrigal, J. L., et al. Quantificazione delle particelle simili al virus del Norovirus umano che si legano ai batteri commensali utilizzando la citometria a flusso. J. Vis. Exp. (2020).

Questo video mostra un test per quantificare le particelle virus-simili al norovirus umano (VLP) che si legano ai batteri intestinali umani. Le sospensioni batteriche vengono miscelate con le VLP e incubate per consentire la formazione di complessi VLP-batteri. I complessi vengono quindi marcati con anticorpi specifici VLP marcati con fluorofori, seguiti da visualizzazione e quantificazione basate sulla citometria a flusso per identificare la percentuale di batteri legati a VLP.

Protocollo

1. Saggio di attacco dei batteri VLP

ATTENZIONE: Le VLP del norovirus umano sono un pericolo di livello di biosicurezza (BSL)-2 e tutto il lavoro che coinvolge le VLP deve essere eseguito in una cabina di biosicurezza. La preparazione delle colture batteriche prima del saggio di attacco deve essere eseguita utilizzando condizioni di sicurezza adeguate per l'organismo.

1. Preparazione del reagente
   1. 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)
      1. Preparare 1 L di PBS 10x sciogliendo una bustina in 1 L di acqua deionizzata (DI).
      2. Soluzione in autocl....

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Provette a fondo tondo in polistrene da 5 ml con tappo per filtro cellulare	Corning	352235	Dopo la colorazione degli anticorpi, il campione viene trasferito in provette per l'analisi della citometria a flusso.
AnaeroPack	Termo Scientifico	R681001	Impacco di gas anaerobico utilizzato per la coltura di Lactobacillus gasseri
BD FacsDiva software
Citometro a flusso BD LSR Fortessa
Albumina sierica bovina	Fisher Bioreagenti	BP1605	Utilizzato per la citometria a flusso
tampone colorante per citometria a flusso (FCSB)	BD Bioscienze	554657	Utilizzato per la citometria a flusso
Controllo dell'isotipo kappa IgG2b di topo (eBMG2b), PE, eBioscience	Thermo Fisher Scientifico	12473281	Controllo degli isotipi. Questo anticorpo viene acquistato in forma coniugata dal produttore.
MRS Polvere	BD Bioscienze	Codice 288130	Utilizzato per la preparazione di terreni e per la coltura di Lactobacillus gasseri.
Anticorpo monoclonale Norovirus capside G2 (L34D)	Thermo Fisher Scientifico	MA5-18241	Anticorpo Norovirus GII. Questo anticorpo è disponibile solo nella forma non coniugata e quindi deve essere coniugato in fluorescenza prima di essere utilizzato nei saggi di citometria a flusso descritti. In questo protocollo, il PE è stato il fluorismo scelto, tuttavia, altre molecole fluorescenti possono essere scelte come meglio si adattano al citometro a flusso utilizzato dal ricercatore.
Norovirus GII.4 VLP	Biostruttura creativa	CBS-V700	Le particelle simili al virus del norovirus umano, le VLP sono state generate utilizzando il sistema del baculovirus e risospese in soluzione salina tamponata con fosfato con glicerolo al 10%. Gli autori hanno eseguito un'analisi indipendente di tracciamento nanosight per determinare la concentrazione di particelle delle VLP. La concentrazione è di circa 1011 VLP per millilitro. Sulla base della concentrazione proteica delle VLP, nei saggi di attacco VLP vengono aggiunte circa 200 particelle per batterio.
PBS 10X	Fisher Bioreagenti	BP665	Diluire a 1 volta prima dell'uso.
Kit di marcatura degli anticorpi SiteClick R-PE	Thermo Fisher Scientifico	S10467	Kit di coniugazione utilizzato per la leggiatura di anticorpi non coniugati.
cloruro di sodio	Fisher Scientifico	S271	Utilizzato per la preparazione dei terreni
Triptone	Ossoide	LP0042	Utilizzato per la preparazione dei terreni
Revolver a tubo	ThermoFisher Scientifico	88881001	Utilizzato nel test di attaccamento virus:batterio. Impostare la velocità massima (40 giri/min).
Estratto di lievito	BD Bioscienze	Codice 212750	Utilizzato per la preparazione dei terreni
agar	sigma	Visualizzazione del materiale A7002	Utilizzato per la preparazione dei terreni