Un test per quantificare il legame delle VLP del Norovirus umano ai batteri intestinali

Abstract

Fonte: Madrigal, J. L., et al. Quantificazione delle particelle simili al virus del Norovirus umano che si legano ai batteri commensali utilizzando la citometria a flusso. J. Vis. Exp. (2020).

Questo video mostra un test per quantificare le particelle virus-simili al norovirus umano (VLP) che si legano ai batteri intestinali umani. Le sospensioni batteriche vengono miscelate con le VLP e incubate per consentire la formazione di complessi VLP-batteri. I complessi vengono quindi marcati con anticorpi specifici VLP marcati con fluorofori, seguiti da visualizzazione e quantificazione basate sulla citometria a flusso per identificare la percentuale di batteri legati a VLP.

Protocollo

1. Saggio di attacco dei batteri VLP

ATTENZIONE: Le VLP del norovirus umano sono un pericolo di livello di biosicurezza (BSL)-2 e tutto il lavoro che coinvolge le VLP deve essere eseguito in una cabina di biosicurezza. La preparazione delle colture batteriche prima del saggio di attacco deve essere eseguita utilizzando condizioni di sicurezza adeguate per l'organismo.

1. Preparazione del reagente
   1. 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)
      1. Preparare 1 L di PBS 10x sciogliendo una bustina in 1 L di acqua deionizzata (DI).
      2. Soluzione in autoclave per 30 min.
      3. Preparare una soluzione 1x diluendo la soluzione di cui sopra 1:10 in acqua deionizzata.
      4. Filtro sterilizzare la soluzione facendola passare attraverso un filtro da 0,22 μm e conservandola a temperatura ambiente.
   2. 5% BSA
      1. Aggiungere 5 g di polvere di albumina sierica bovina (BSA) a 100 mL di PBS per generare una soluzione al 5% (p/v).
      2. Mescolare la soluzione agitando a vortice o utilizzando un'ancoretta metallica su una piastra di agitazione fino a quando i grumi non si sono sciolti.
      3. Sterilizzare con filtro da 0,22 μm.
      4. Conservare la soluzione a 4 °C.
   3. tampone colorante per citometria a flusso (FCSB)
      1. Filtrare l'FCSB acquistato (vedi Tabella dei materiali) attraverso un filtro da 0,22 μm.
      2. Conservare la soluzione rimanente a 4 °C.
   4. 5% Buffer di blocco (BB)
      nota: Preparare fresco ogni volta.
      1. Aggiungere 0,5 g di BSA a 10 ml di FCSB sterile.
      2. Vortice per mescolare accuratamente il campione e lasciare in ghiaccio fino al momento dell'uso.
2. Coniugazione degli anticorpi
   1. Coniugare l'anticorpo GII del norovirus umano (vedere la Tabella dei materiali) con la r-ficoeritrina (PE) utilizzando un kit di marcatura degli anticorpi R-PE secondo le istruzioni del produttore (vedere la Tabella dei materiali).
   2. Conservare l'anticorpo coniugato al buio a 4 °C per un uso futuro nell'analisi del saggio di attacco del batterio VLP.
      nota: L'anticorpo primario deve essere titolato prima dell'uso nel saggio di attacco VLP-batteri per determinare la concentrazione corretta necessaria per l'analisi di citometria a flusso. La titolazione degli anticorpi deve essere eseguita ogni volta che viene eseguita la reazione di coniugazione e per ogni batterio utilizzato nel saggio di attacco.
3. Titolazione degli anticorpi
   1. Diluire l'anticorpo GII coniugato anti-norovirus umano GII 100 volte, con una diluizione iniziale di 1:100 e una diluizione finale di 1:600 (sei diluizioni in totale).
   2. Eseguire un test di attacco del virus come descritto di seguito, con la seguente eccezione: al punto 1.5.7, risospendere il pellet batterico in 350 μL di BB al 5%.
   3. Dividere il campione in sette aliquote da 50 μL.
   4. Aggiungere 50 μl di ciascuna diluizione di anticorpi in una provetta.
   5. Aggiungere 50 μl di BB al 5% alla settima provetta come controllo non colorato.
   6. Eseguire la citometria a flusso su tutti i campioni come descritto di seguito.
   7. Confrontare i campioni di anticorpi diluiti con i controlli non colorati e tra loro. Per i test successivi deve essere scelta la concentrazione di anticorpi più bassa che non determini una diminuzione o una perdita del segnale positivo.
4. Preparazione di batteri
   1. Far crescere i batteri in 40 mL di terreno liquido appropriato in condizioni atmosferiche adeguate fino a quando i batteri non sono in fase stazionaria.
      1. Coltivare le colture di Enterobacter cloacae in modo aerobico durante la notte in brodo di Luria a 37 °C, agitando a 200 giri/min per raggiungere la fase stazionaria.
      2. Coltiva colture di Lactobacillus gasseri in brodo De Man, Rogosa e Sharpe (MRS) in provette nere con tappo a vite senza agitare in un bagno d'acqua impostato a 37 °C per 18 ore per raggiungere la fase stazionaria.
   2. Trasferire colture in fase stazionaria per pulire provette coniche da 50 mL e centrifugare campioni a 2.288 x g per 10 minuti per pellettare i batteri.
   3. Rimuovere il surnatante e risospenderlo in 13 mL di PBS sterile 1x. Ripetere questa fase di lavaggio per un totale di due lavaggi.
   4. Centrifugare nuovamente i campioni, rimuovere il surnatante e risospendere i campioni in 20 mL di 1x PBS.
      nota: Se il pellet di cella è piccolo, il volume di risospensione può essere diminuito.
   5. Misurare il diametro esterno₆₀₀ della coltura.
   6. Utilizzando una curva standard, determinare l'unità formante colonia (CFU) per mL della coltura lavata.
   7. Diluire i batteri con 1x PBS per regolare la concentrazione della coltura a 1 x 10⁸ CFU/mL.
   8. Trasferire 1 mL della coltura batterica 1 x 10⁸ CFU/mL nelle provette da centrifuga da 1,5 mL richieste.
   9. Centrifugare le provette a 10.000 x g per 5 min.
   10. Risospendere il pellet batterico in 1 mL di BSA sterile al 5%.
   11. Incubare le provette per 1 ora a 37 °C con rotazione costante.
5. Allegato virus
   1. Lavorando all'interno di una cabina di biosicurezza BSL-2, aggiungere 10 μg di VLP del norovirus umano (HuNoV) (vedere la Tabella dei materiali) a ciascuna provetta contenente batteri risospesi in PBS e mescolare accuratamente mediante pipettaggio.
      nota: La concentrazione di VLP differisce con ogni preparazione di VLP. Pertanto, il volume aggiunto ai batteri varierà tra i lotti di preparazione e dovrebbe essere regolato di conseguenza in modo che vengano aggiunti 10 μg a ciascuna provetta nell'esperimento. Per i controlli solo batterici (ad esempio, campioni senza VLP), aggiungere un volume di PBS uguale al volume di VLP aggiunto ai campioni sperimentali.
   2. Incubare le provette per 1 ora a 37 °C con rotazione costante.
      NOTA: Durante l'incubazione viene utilizzato un revolver a tubo (vedi Tabella dei materiali) impostato su 40 giri/min.
   3. Dopo l'incubazione, centrifugare i campioni a 10.000 x g per 5 minuti.
   4. Scartare il surnatante e risospendere il pellet batterico in 1 mL di PBS.
   5. Ripetere le fasi di lavaggio 1.5.3 e 1.5.4.
   6. Centrifugare i campioni a 10.000 x g per 5 minuti.
   7. Scartare il surnatante e risospendere il pellet batterico in 150 μL di BB al 5%.
6. Colorazione degli anticorpi
   1. Preparare fresco 5% BB.
      NOTA: Tutti i lavori che utilizzano l'anticorpo marcato con fluorescenza devono essere eseguiti al buio e gli anticorpi, BB e FCSB devono essere mantenuti in ghiaccio.
   2. Diluire l'anticorpo GII del norovirus umano 1:125 per i campioni di E. cloacae e 1:150 per i campioni di L. gasseri in BB al 5%, preparando 50 μl di anticorpo diluito per campione.
   3. Diluire l'anticorpo isotipo nello stesso modo in cui l'anticorpo GII del norovirus umano è stato diluito per ciascun batterio in BB al 5%, preparando 50 μL di controllo isotipo diluito per campione.
   4. Dividere ciascun campione di saggio di attacco della fase 1.3.7 in tre aliquote da 50 μL trasferendole in provette da centrifuga pulite da 1,5 mL.
   5. Alla prima serie di campioni, aggiungere 50 μl di BB. Questo set sarà il controllo non colorato (Uns).
   6. Aggiungere 50 μl di diluizione dell'anticorpo GII al secondo set. Ciò si traduce in una concentrazione finale di anticorpi di 1:250 per E. cloacae e 1:300 per L. gasseri. Questo set di campioni sarà costituito da campioni colorati (AB).
   7. Aggiungere 50 μl dell'anticorpo isotipo diluito al terzo set. Questo set sarà il controllo isotipo (IC). Mescolare bene pipettando. Incubare i campioni su ghiaccio e al buio per 30 minuti.
   8. Centrifugare tutti i campioni a 10.000 x g per 5 minuti.
   9. Scartare il surnatante e risospendere i campioni in 100 μL di FCSB.
   10. Centrifugare tutti i campioni a 10.000 x g per 5 minuti. Scartare il surnatante e risospendere i campioni in 100 μl di FCSB.
   11. Centrifugare tutti i campioni a 10.000 x g per 5 minuti.
   12. Scartare il surnatante e risospendere i campioni in 150 μL di FCSB.
   13. Trasferire ogni campione in una provetta FCSB contenente 400 μl di tampone FCSB per un volume totale di 550 μl.
   14. Conservare i campioni a 4 °C fino a quando non vengono analizzati mediante citometria a flusso.
       nota: La citometria a flusso viene eseguita entro 4 ore dalla colorazione degli anticorpi.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Provette a fondo tondo in polistrene da 5 ml con tappo per filtro cellulare	Corning	352235	Dopo la colorazione degli anticorpi, il campione viene trasferito in provette per l'analisi della citometria a flusso.
AnaeroPack	Termo Scientifico	R681001	Impacco di gas anaerobico utilizzato per la coltura di Lactobacillus gasseri
BD FacsDiva software
Citometro a flusso BD LSR Fortessa
Albumina sierica bovina	Fisher Bioreagenti	BP1605	Utilizzato per la citometria a flusso
tampone colorante per citometria a flusso (FCSB)	BD Bioscienze	554657	Utilizzato per la citometria a flusso
Controllo dell'isotipo kappa IgG2b di topo (eBMG2b), PE, eBioscience	Thermo Fisher Scientifico	12473281	Controllo degli isotipi. Questo anticorpo viene acquistato in forma coniugata dal produttore.
MRS Polvere	BD Bioscienze	Codice 288130	Utilizzato per la preparazione di terreni e per la coltura di Lactobacillus gasseri.
Anticorpo monoclonale Norovirus capside G2 (L34D)	Thermo Fisher Scientifico	MA5-18241	Anticorpo Norovirus GII. Questo anticorpo è disponibile solo nella forma non coniugata e quindi deve essere coniugato in fluorescenza prima di essere utilizzato nei saggi di citometria a flusso descritti. In questo protocollo, il PE è stato il fluorismo scelto, tuttavia, altre molecole fluorescenti possono essere scelte come meglio si adattano al citometro a flusso utilizzato dal ricercatore.
Norovirus GII.4 VLP	Biostruttura creativa	CBS-V700	Le particelle simili al virus del norovirus umano, le VLP sono state generate utilizzando il sistema del baculovirus e risospese in soluzione salina tamponata con fosfato con glicerolo al 10%. Gli autori hanno eseguito un'analisi indipendente di tracciamento nanosight per determinare la concentrazione di particelle delle VLP. La concentrazione è di circa 1011 VLP per millilitro. Sulla base della concentrazione proteica delle VLP, nei saggi di attacco VLP vengono aggiunte circa 200 particelle per batterio.
PBS 10X	Fisher Bioreagenti	BP665	Diluire a 1 volta prima dell'uso.
Kit di marcatura degli anticorpi SiteClick R-PE	Thermo Fisher Scientifico	S10467	Kit di coniugazione utilizzato per la leggiatura di anticorpi non coniugati.
cloruro di sodio	Fisher Scientifico	S271	Utilizzato per la preparazione dei terreni
Triptone	Ossoide	LP0042	Utilizzato per la preparazione dei terreni
Revolver a tubo	ThermoFisher Scientifico	88881001	Utilizzato nel test di attaccamento virus:batterio. Impostare la velocità massima (40 giri/min).
Estratto di lievito	BD Bioscienze	Codice 212750	Utilizzato per la preparazione dei terreni
agar	sigma	Visualizzazione del materiale A7002	Utilizzato per la preparazione dei terreni