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Articolo metodologico

Un test per quantificare il legame delle VLP del Norovirus umano ai batteri intestinali

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8 luglio 2025

In questo articolo

Abstract

Fonte: Madrigal, J. L., et al. Quantificazione delle particelle simili al virus del Norovirus umano che si legano ai batteri commensali utilizzando la citometria a flusso. J. Vis. Exp. (2020).

Questo video mostra un test per quantificare le particelle virus-simili al norovirus umano (VLP) che si legano ai batteri intestinali umani. Le sospensioni batteriche vengono miscelate con le VLP e incubate per consentire la formazione di complessi VLP-batteri. I complessi vengono quindi marcati con anticorpi specifici VLP marcati con fluorofori, seguiti da visualizzazione e quantificazione basate sulla citometria a flusso per identificare la percentuale di batteri legati a VLP.

Protocollo

1. Saggio di attacco dei batteri VLP

ATTENZIONE: Le VLP del norovirus umano sono un pericolo di livello di biosicurezza (BSL)-2 e tutto il lavoro che coinvolge le VLP deve essere eseguito in una cabina di biosicurezza. La preparazione delle colture batteriche prima del saggio di attacco deve essere eseguita utilizzando condizioni di sicurezza adeguate per l'organismo.

  1. Preparazione del reagente
    1. 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)
      1. Preparare 1 L di PBS 10x sciogliendo una bustina in 1 L di acqua deionizzata (DI).
      2. Soluzione in autocl....

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Dichiarazioni

Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provette a fondo tondo in polistrene da 5 ml con tappo per filtro cellulareCorning352235Dopo la colorazione degli anticorpi, il campione viene trasferito in provette per l'analisi della citometria a flusso.
AnaeroPackTermo ScientificoR681001Impacco di gas anaerobico utilizzato per la coltura di Lactobacillus gasseri
BD FacsDiva software
Citometro a flusso BD LSR Fortessa
Albumina sierica bovinaFisher BioreagentiBP1605Utilizzato per la citometria a flusso
tampone colorante per citometria a flusso (FCSB)BD Bioscienze554657Utilizzato per la citometria a flusso
Controllo dell'isotipo kappa IgG2b di topo (eBMG2b), PE, eBioscienceThermo Fisher Scientifico12473281Controllo degli isotipi. Questo anticorpo viene acquistato in forma coniugata dal produttore.
MRS PolvereBD BioscienzeCodice 288130Utilizzato per la preparazione di terreni e per la coltura di Lactobacillus gasseri.
Anticorpo monoclonale Norovirus capside G2 (L34D)Thermo Fisher ScientificoMA5-18241Anticorpo Norovirus GII. Questo anticorpo è disponibile solo nella forma non coniugata e quindi deve essere coniugato in fluorescenza prima di essere utilizzato nei saggi di citometria a flusso descritti. In questo protocollo, il PE è stato il fluorismo scelto, tuttavia, altre molecole fluorescenti possono essere scelte come meglio si adattano al citometro a flusso utilizzato dal ricercatore.
Norovirus GII.4 VLPBiostruttura creativaCBS-V700Le particelle simili al virus del norovirus umano, le VLP sono state generate utilizzando il sistema del baculovirus e risospese in soluzione salina tamponata con fosfato con glicerolo al 10%. Gli autori hanno eseguito un'analisi indipendente di tracciamento nanosight per determinare la concentrazione di particelle delle VLP. La concentrazione è di circa 1011 VLP per millilitro. Sulla base della concentrazione proteica delle VLP, nei saggi di attacco VLP vengono aggiunte circa 200 particelle per batterio.
PBS 10XFisher BioreagentiBP665Diluire a 1 volta prima dell'uso.
Kit di marcatura degli anticorpi SiteClick R-PEThermo Fisher ScientificoS10467Kit di coniugazione utilizzato per la leggiatura di anticorpi non coniugati.
cloruro di sodioFisher ScientificoS271Utilizzato per la preparazione dei terreni
TriptoneOssoideLP0042Utilizzato per la preparazione dei terreni
Revolver a tuboThermoFisher Scientifico88881001Utilizzato nel test di attaccamento virus:batterio. Impostare la velocità massima (40 giri/min).
Estratto di lievitoBD BioscienzeCodice 212750Utilizzato per la preparazione dei terreni
agarsigmaVisualizzazione del materiale A7002Utilizzato per la preparazione dei terreni

Tag

Particelle simil viralicitometria a flussocomplessi VLP batterianticorpi fluorescentisaggio di legame battericoprotocollo di centrifugazionesoluzione di bloccocappa a flusso laminare di biosicurezza