1. Rilevamento della mitofagia in C. elegans
NOTA: Il nematode C. elegans fornisce una piattaforma per saggiare la mitofagia a livello dell'organismo. Due ceppi possono essere utilizzati per monitorare la mitofagia: (1) Rosella mirata ai mitocondri (mtRosella) o (2) recettore della mitofagia DCT-1 fuso con GFP insieme al marcatore autofagosomico LGG-1 fuso con Discosoma sp. proteina fluorescente rossa (DsRed).
- Monitoraggio della mitofagia con il biosensore Rosella
NOTA: Rosella è un biosensore molecolare che combina un DsRed insensibile al pH fuso con una variante GFP sensibile al pH. Il biosensore Rosella sfrutta le differenze di pH tra il lisosoma acido (pH ~4,5) e altri compartimenti cellulari. Questo biosensore è stato utilizzato per monitorare con successo la mitofagia in Saccharomyces cerevisiae e in diverse linee cellulari di mammiferi, come HeLa, HEK293 e HCT116. Abbiamo adattato questo versatile reporter a doppia fluorescenza e generato nematodi transgenici di C. elegans che esprimono Rosella mirata ai mitocondri (mtRosella) nelle cellule muscolari della parete corporea. L'induzione della mitofagia è indicata da un ridotto rapporto GFP/DsRed della fluorescenza mtRosella.
- Giorno 1: Prelevare larve L4 di vermi che esprimono Rosella mirata ai mitocondri (mtRosella) nelle cellule muscolari della parete corporea su una piastra di terreno di crescita per nematodi (NGM) seminata con E. coli (OP50) utilizzando un microscopio da dissezione. Posizionare 10-20 vermi/piatto su almeno tre piatti da 3,5 cm. Incubare i nematodi alla temperatura standard di 20 °C.
nota: Vedi riferimento per l'anatomia del verme, inclusa l'identificazione delle larve L4 e il modo di fare un plettro che viene utilizzato per trasferire i vermi da un luogo all'altro.
- Giorno 5: Sincronizzare i nematodi selezionando 15-20 larve transgeniche L4 e trasferendole su una piastra NGM fresca con semina OP50. Utilizzare almeno cinque piastre per condizione sperimentale.
- Giorno 7: Preparare le targhe dei veicoli per i farmaci di interesse che influenzano la mitofagia o per i controlli positivi.
- Uccidere i batteri E. coli (OP50) seminati esponendo piastre NGM per 15 minuti con 222 μW/cm2 (intensità) di luce UV per garantire che i composti che inducono la mitofagia non vengano metabolizzati dai batteri. Le lastre devono essere esposte con 2.000 J/m2.
NOTA: Secondi di esposizione necessari = 2.000/((intensità in μW/cm2)*100).
- Aggiungere i composti di interesse alla parte superiore delle piastre NGM seminate. Aggiungere una quantità equivalente di composto veicolo (solvente utilizzato per sciogliere il composto, come il dimetilsolfossido (DMSO)) alle targhe del veicolo come controllo negativo. Per il controllo positivo dell'induzione della mitofagia è stato utilizzato un tossico mitocondriale, il paraquat (concentrazione finale di 8 mM). Aggiungere una soluzione contenente 10 μl di paraquat 8 M con 190 μl di ddH2O sulla parte superiore della piastra di agar per il gruppo da trattare. Per il gruppo di veicoli, aggiungere una soluzione contenente 10 μl di DMSO con 190 μl di ddH2O sulla parte superiore della piastra di agar.
nota: La soluzione di funzionamento del paraquat può essere conservata per 1 mese a 4 °C.
- Agitare delicatamente le piastre fino a quando il farmaco o il veicolo non ricoprono l'intera superficie. Lasciare asciugare le piastre con i coperchi chiusi a temperatura ambiente per almeno 1 ora prima di trasferire i vermi.
nota: Le piastre per farmaci possono anche essere preparate aggiungendo farmaci nell'NGM liquido prima che si solidifichi.
- Giorno 7: Trasferire 10-20 animali transgenici adulti di 2 giorni preparati nella fase 2.1.2 su piastre contenenti paraquat, composto di interesse o veicolo (DMSO). Incubare gli animali transgenici a 20 °C per 2 giorni.
- Giorno 9: Preparare pastiglie di agarosio al 2%. Quindi aggiungere una goccia (10 μL) di 20 mM di levamisolo in M9 per pad. Immobilizzare gli animali transgenici per l'imaging, inserendoli nella goccia M9-levamisolo. Posiziona delicatamente un vetrino coprioggetti sulla parte superiore.
- Cattura singoli animali transgenici utilizzando una fotocamera collegata a un microscopio a epifluorescenza. Acquisizione di immagini fluorescenti di nematodi transgenici interi che esprimono mtRosella nelle cellule muscolari della parete corporea con ingrandimento 10X. Salva le immagini raccolte.
- Elaborare le immagini acquisite con il software ImageJ. Analizza le cellule muscolari della parete corporea situate nella testa del verme per evitare l'autofluorescenza nel tessuto intestinale. Misura il valore medio dell'intensità dei pixel e l'area totale per ogni immagine fluorescente solo della regione della testa di ciascun animale. Per analizzare l'area specifica di interesse:
- Seleziona "canale diviso" nel menu a discesa "immagine" e "colore" per convertire le immagini.
- Utilizza lo strumento di "selezione a mano libera" per catturare l'area fluorescente di interesse.
- Selezionare il comando "misurazione" nel menu a discesa "analizza" ed eseguire l'analisi dell'intensità dei pixel.
- L'intensità dei pixel deve essere normalizzata dividendo l'intensità per l'area totale analizzata. Al momento della normalizzazione, calcolare il rapporto GFP/DsRed.
- Utilizzare il software di analisi statistica per condurre il t-test degli studenti (confronto tra due gruppi) o l'ANOVA (confronto tra più gruppi) per l'analisi statistica con p < 0,05 come significativo.
- Valutazione della mitofagia mediante co-localizzazione tra DCT-1 e LGG-1
NOTA: DCT-1 è una proteina della membrana mitocondriale esterna che agisce come recettore della mitofagia in risposta a condizioni di stress, in modo simile ai suoi ortologhi putativi BNIP3 e NIX/BNIP3L nei mammiferi. Pertanto, l'inizio della mitofagia è valutato mediante co-localizzazione tra il recettore della mitofagia DCT-1 e la proteina di membrana autofagosomica LGG-1 (omologa della LC3 dei mammiferi).
- Giorno 1: Prelevare larve L4 di animali transgenici che esprimono sia DCT-1::GFP che DsRed::LGG-1 nelle cellule muscolari della parete corporea5 su una piastra NGM seminata OP50. Posizionare 5-10 vermi/piastra da 3,5 cm e utilizzare almeno tre piatti. Incubare i nematodi a 20 °C.
nota: I transgeni si trovano su plasmidi separati e non sono integrati nel genoma. Raccogliere i nematodi portatori di marcatori di contrasformazione GFP rol-6(su1006) e pmyo-2. Solo i vermi transgenici con entrambi i marcatori di contrasformazione esprimono sia DCT-1::GFP che DsRed::LGG-1 nelle cellule muscolari della parete corporea.
- Segui i passaggi da 1.1.2 a 1.1.5.
- Imaging di singole cellule muscolari della parete corporea utilizzando una fotocamera collegata a un microscopio confocale. Rileva i bordi delle cellule muscolari dell'intera parete corporea e scatta immagini z-stack con un ingrandimento di 63x. È possibile utilizzare anche un ingrandimento maggiore.
- Aprire ed elaborare le immagini acquisite con il software confocale. L'inizio della mitofagia è indicato dalla co-localizzazione del recettore della mitofagia (DCT-1::GFP) al marcatore autofagosomico (DsRed::LGG-1). Misura manualmente gli eventi di co-localizzazione in ogni pila di cellule muscolari della parete corporea. È essenziale mantenere coerenti tutte le impostazioni del microscopio e della fotocamera (obiettivo e lente d'ingrandimento, filtri, tempo di esposizione, risoluzione, intensità laser, guadagno, ecc.) durante gli esperimenti. Tutte le impostazioni devono essere annotate.
- Utilizzare il software di analisi statistica per condurre il t-test degli studenti (confronto tra due gruppi) o l'ANOVA (confronto tra più gruppi) per l'analisi statistica con p < 0,05 come significativo. Per confronti a due vie utilizzare il test t di Student (p < 0,05 è considerato significativo). Per confronti multipli utilizzare l'analisi della varianza a fattore singolo (ANOVA), corretta dal test post hoc di Bonferroni. Si consiglia di analizzare almeno 50-70 animali o 30-50 cellule muscolari della parete corporea per ogni condizione sperimentale. Ripeti l'esperimento almeno tre volte.
