Un test immunologico per elettroforesi capillare per il rilevamento di biomarcatori proteici

Abstract

Fonte: Sage, J. M., et al. Uso del test immunologico per elettroforesi capillare per cercare potenziali biomarcatori della sclerosi laterale amiotrofica nelle piastrine umane.J. Vis. Exp.(2020)

Questo video mostra un protocollo di immunodosaggio per elettroforesi capillare per rilevare un biomarcatore proteico associato alla sclerosi laterale amiotrofica (SLA) dalle piastrine del sangue umano. La conferma della presenza della proteina biomarcatrice della SLA si ottiene attraverso la separazione delle proteine piastriniche basata sulle dimensioni seguita dalla rilevazione chemiluminescente.

Protocollo

Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.

1. Preparazione di tamponi e reagenti

NOTA: Prepara tutti i campioni secondo le linee guida del produttore. Durante questa procedura, indossare dispositivi di protezione individuale (camici da laboratorio, guanti e occhiali).

1. Preparare il tampone di lavaggio citrato combinando 0,941 g di saccarosio (concentrazione finale 11 mM), 6,4 mL di cloruro di sodio 5 M (NaCl, 128 mM finale), 5,4 mL di fosfato monosodico 0,2 M (NaH₂PO₄, 4,3 mM finale), 9,4 mL di fosfato disodico 0,2 M (Na₂HPO₄, 7,5 mM finale), 0,352 g di citrato di sodio (4,8 mM finale), e 0,115 g di acido citrico (2,4 mM finale). Regolare il volume totale a 250 mL con ddH₂O. Filtrare attraverso un disco filtrante da 0,45 μm e regolare il pH a 6,5. Conservare fino a 1 anno a 4 °C. Portare la soluzione a temperatura ambiente (RT) prima dell'uso.
2. Preparare il tampone di rottura combinando 250 mM di saccarosio, 1 mM di acido etilendiammina tetraacetico (EDTA) e 10 mM di Tris (idrossimetil) amminometano cloridrato (Tris-Cl, pH 7,4) in un volume finale di 100 mL. Conservare fino a 1 anno a 4 °C. Aggiungere 2 μL di cocktail di inibitori della fosfatasi (1:1000 final) e 1 μL di cocktail di inibitori della proteasi (1:2000 final) in 2 mL di tampone di rottura. Tenere in ghiaccio fino al momento dell'uso. Eliminare il tampone di rottura inutilizzato.

2. Isolamento piastrinico

1. Raccogliere 8-10 ml di sangue umano in una provetta per la raccolta del sangue con tappo giallo contenente una soluzione acido-citrato-destrosio (ACD) (75 mM di citrato trisodico, 124 mM di destrosio e 38 mM di acido citrico, pH = 7,4; ACD: sangue = 1:9). Mescolare delicatamente il contenuto del tubo 5x–6x invertendo a mano.
2. Centrifugare le provette a 200 x g in un rotore a secchiello oscillante per 20 minuti a RT.
3. Raccogliere il plasma ricco di piastrine (PRP) (~3-4 mL) in una provetta a fondo conico da 15 mL e lasciare circa 0,5 mL di PRP dal buffy coat (frazione dall'aspetto nebuloso) per evitare contaminazioni. Se si verifica una contaminazione dei globuli rossi, ripetere questo passaggio.
4. Centrifugare i campioni di PRP a 1.200 x g per 15 minuti a RT.
5. Lavare i pellet piastrinici (P1) mediante risospensione delicata in 1 mL di tampone di lavaggio citrato e il pellet mediante centrifugazione a 1.200 x g per 15 minuti a RT.
6. Conservare il pellet di piastrine puro. Scartare il surnatante.
7. Risospendere i pellet piastrinici in 600 μl del tampone di rottura contenente cocktail di inibitori.
8. Sonicare la sospensione piastrinica utilizzando un sonicatore. Posizionare il campione in un mini secchiello per il ghiaccio. Impostare il sonicatore sull'impostazione 3 per 20 s in modalità continua.
   NOTA: Pulire la sonda con candeggina al 10% seguita da acqua distillata.
9. Centrifugare i campioni sonicati a 20.000 x g per 30 minuti a 4 °C per rimuovere le frazioni membranose. Aliquotare i surnatanti in 60 μl e conservare a -80 °C. Evitare ripetuti cicli di scongelamento/congelamento per le frazioni citosoliche piastriniche.

3. Preparazione per il test immunologico di elettroforesi capillare (CEI)

NOTA: 100 μL di lisato piastrinico umano sono stati combinati da pazienti affetti da SLA (n = 8-10) e soggetti sani (n = 8-10) sono stati raggruppati separatamente e utilizzati per l'ottimizzazione del test.

1. Compila i modelli generati internamente per il layout CEI (Tabella 1) e la preparazione dei campioni (Tabella 2). La tabella di preparazione della miscela del campione è dinamica e calcolerà automaticamente la quantità di volume che deve essere rimossa dalla fonte.
   NOTA: Quando il volume sorgente richiesto viene inserito nella tabella dinamica 2, verrà calcolato automaticamente un volume del buffer di campionamento 0,1 X.
2. Pre-etichettare 25 provette per PCR da 0,2 mL con capillari #1–#25 e posizionarle in un rack per PCR. Mettere sul ghiaccio.
3. Provette per microcentrifuga da 0,6 mL pre-marcate: una per ogni anticorpo primario e diluizione (se necessaria) da utilizzare, una per il tampone campione 0,1x, una per il luminol-S/perossido e una per ogni campione da diluire (se necessario). Metterli sul ghiaccio in una griglia per provette.
4. Estrarre il tampone del campione, il tampone di lavaggio, una piastra e una cartuccia forniti nel modulo di separazione CEI 12-230 kDa master kit.
5. Dal frigorifero a 4 °C, estrarre il tampone di diluizione degli anticorpi, gli anticorpi primari, gli anticorpi secondari, il luminolo, il perossido di idrogeno e la confezione standard. Mettere tutti i reagenti sul ghiaccio tranne la confezione standard, che rimane a RT.
   NOTA: I reagenti delle confezioni standard sono liofilizzati e sigillati con un coperchio di alluminio. Per ridurre la perdita di prodotto, questi devono essere centrifugati brevemente utilizzando una mini centrifuga prima dell'apertura. Per aprirsi, le provette dei reagenti possono essere forate da una punta di pipetta o tirate indietro dall'angolo.
6. Per preparare il ditiotreitolo (DTT) da 400 mM, aggiungere 40 μL di acqua deionizzata alla provetta trasparente contenente il DTT.
7. Per preparare 40 μl di master mix fluorescente 5x, aggiungere 20 μl del tampone campione 10x e 20 μl della soluzione DTT 400 mM preparata alla provetta rosa fornita nel kit.
8. Per preparare la scala biotinilata, aggiungere 16 μl di acqua deionizzata, 2 μl di tampone campione 10x e 2 μl della soluzione DTT da 400 mM preparata alla provetta bianca fornita nel kit. Mescolare delicatamente e trasferire in una provetta da 0,2 mL di reazione a catena della polimerasi (PCR) per la denaturazione.
9. Preparare il tampone del campione 0,1x aggiungendo 1,5 μL di tampone del campione 10x e 148,5 μL di acqua deionizzata a una provetta per microcentrifuga da 0,6 mL. Vortice per mescolare e mettere sul ghiaccio.
10. Preparare le diluizioni anticorpali desiderate. Aggiungere il diluente anticorpale nei volumi designati a ciascuna provetta per microcentrifuga pre-marcata. Se i volumi sono identici, utilizzare la tecnica del pipettaggio inverso; In caso contrario, pre-sciacquare il puntale della pipetta prima dell'erogazione.
    NOTA: In questo test sono stati utilizzati l'anticorpo pan A-TDP-43 e l'anticorpo a-p(S409/410-2) TDP-43. L'anticorpo anti-ERK è stato utilizzato per il controllo interno per garantire il funzionamento dei componenti del test.
11. Eseguire il pipettaggio inverso per la diluizione degli anticorpi come descritto di seguito. In alternativa, ulteriori informazioni possono essere trovate in letteratura.
    NOTA: Il pipettaggio inverso è preferibile quando si dispensano piccoli volumi sequenziali di soluzioni. Questa tecnica offre alcuni vantaggi: (i) fornisce un volume preciso, (ii) elimina la formazione di schiuma del reagente nell'orifizio della punta e (iii) è ideale per reagenti di piccolo volume (<5 μL), soluzioni viscose, soluzioni tensioattive e soluzioni con elevata pressione di vapore.
    1. Inserire un puntale adeguato in una pipetta e premere lo stantuffo fino al secondo arresto (passaggio 2). Immergere la punta della pipetta per alcuni millimetri nella soluzione. Rilasciare lentamente lo stantuffo per riempire il puntale della pipetta con la soluzione mentre il puntale è ancora immerso. Rimuovere il puntale dalla soluzione e toccare delicatamente il bordo del serbatoio del reagente in modo da rimuovere il liquido in eccesso rimasto all'esterno del puntale.
    2. Erogare la soluzione premendo lo stantuffo fino al primo arresto (passaggio 1). Non erogare la soluzione rimanente nella punta.
    3. Svuotare la soluzione rimanente nel puntale nel serbatoio del reagente premendo lo stantuffo fino al secondo arresto (Passaggio 2). Rilasciare lo stantuffo in posizione pronto per la successiva fase di pipettaggio.
    4. Aggiungere l'anticorpo richiesto nei volumi designati a ciascuna provetta per microcentrifuga pre-marcata (Tabella 1). Non presciacquare il puntale della pipetta: aggiungerlo direttamente al diluente e sciacquare il puntale più volte per rimuovere l'anticorpo. Metti i tubi sul ghiaccio.
12. Per preparare la miscela di campioni CEI, eseguire i passaggi elencati di seguito per le provette PCR etichettate da tappo#2 a tappo#25: Questo è nello stesso ordine della Tabella 1.
    1. Aprire tutte le provette, aggiungere aliquote da 1,6 μL di tampone per campioni fluorescenti 5x a ciascuna provetta utilizzando una tecnica di pipettaggio inverso, quindi chiudere ciascuna provetta PCR dopo l'aggiunta del tampone 5x per ridurre al minimo la perdita di campione.
    2. Aprire tutte le provette, aggiungere a ciascuna provetta un tampone di campione 0,1x nei volumi indicati nella Tabella 2 e chiudere subito dopo. Se i volumi sono identici, utilizzare una tecnica di pipettaggio inverso. In caso contrario, presciacquare il puntale della pipetta prima di erogare 0,1 volte il tampone del campione.
    3. Aprire tutte le provette, aggiungere a ciascuna provetta il campione di proteine nei volumi indicati nella Tabella 2, quindi chiudere subito dopo. Se i volumi sono identici, utilizzare la tecnica del pipettaggio inverso. In caso contrario, presciacquare il puntale della pipetta prima di erogare 0,1 volte il tampone del campione.
    4. Centrifugare brevemente tutte le provette per PCR in una centrifuga da banco (13.000 x g per 30 s), muovere/vorticare le provette per PCR per mescolarle, quindi ripetere la centrifugazione.
    5. Trasferire tutte le provette per PCR in un termociclatore con coperchio riscaldato. Denaturare i campioni a temperatura e durata definite (ad esempio, 95 °C per 5 minuti; 70 °C per 10 minuti).
       NOTA: La temperatura e la durata della denaturazione devono essere ottimizzate per la proteina target.
    6. Ripetere il passaggio 3.12.4.
    7. Rimettere tutte le provette PCR nel rack per provette e posizionarle sul ghiaccio.
    8. Durante la fase di denaturazione, preparare la soluzione di sviluppo (1:1 luminol-S: soluzione di perossido), quindi aggiungere 200 μl di luminol-S e 200 μl di perossido. Mettere sul ghiaccio.
    9. Per caricare una piastra preriempita CEI con il campione preparato sopra, erogare reagenti e campioni nella piastra di analisi mostrata nel layout del saggio (Figura 1). Evitare l'introduzione di bolle d'aria.
       NOTA: Se i volumi e la soluzione sono identici, utilizzare una tecnica di pipettaggio inverso. In caso contrario, sciacquare preventivamente il puntale della pipetta prima dell'erogazione e non espellere il resto nella piastra utilizzando il secondo fermo della pipetta. Un modulo di separazione da 12 a 230 kDa può contenere una guida di caricamento delle piastre con codice colore. Posizionare questa guida sotto la piastra durante l'aggiunta di reagenti e campioni al pozzetto, il che aiuta visivamente durante il caricamento del campione. La guida al caricamento delle lastre può essere scaricata anche dal sito web dell'azienda.
       1. aggiungere 15 μL di miscela di luminol: perossido a ciascun pozzetto della riga E.
          NOTA: Idealmente, preparare questo reagente appena prima dell'uso e aggiungerlo a ciascun pozzetto. Se ciò è inconveniente, questa miscela può essere preparata non più di 30 minuti prima del caricamento della lastra.
       2. Nella riga D, al pozzetto D1, aggiungere 10 μL di streptavidina-HRP.
       3. Nella riga D, ai pozzetti D2-D25, aggiungere 10 μL di anticorpo secondario designato.
       4. Nella riga B, aggiungere 10 μl di diluente anticorpale a ciascun pozzetto.
       5. Nella riga C, al pozzetto C1, aggiungere 10 μL di diluente anticorpale.
       6. Nella riga C, ai pozzetti C2-C25, aggiungere 10 μL di anticorpo primario designato.
       7. Nella fila A, al pozzetto A1, aggiungere 5 μL di scala biotinilata dalla provetta PCR #1.
       8. Nella fila A, ai pozzetti A2-A25, aggiungere 3 μl del campione, le provette per PCR #2-#25 nei pozzetti corrispondenti #2-#25.
       9. Aggiungere 500 μl di tampone di lavaggio a ciascun pozzetto del tampone di lavaggio designato.
       10. Centrifugare la piastra per 5 minuti a 1.000 x g a RT.

Tabella 1: Modello di caricamento della piastra del saggio CEI.

Tabella 2: Modello interattivo di preparazione della miscela di campioni. Dopo aver inserito la concentrazione proteica di riserva da campioni sconosciuti, le cellule interattive calcoleranno automaticamente la quantità di volume da utilizzare per preparare la miscela di campioni.

Risultati

Figura 1: Layout del saggio.Sia l'ottimizzazione del campione di anticorpi primari che quella di proteina bersaglio possono essere eseguite in un unico test. I capillari 2-7, 8-13, 14-19 e 20-24 rappresentano varie concentrazioni proteiche e intervalli di anticorpi primari. Il capillare 25 rappresenta il controllo positivo. È stato utilizzato l'anticorpo anti-ERK; Tuttavia, può essere incluso qualsia...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Kit di separazione 12-230 kDa	ProteinSimple	SM-W004	Contiene una piastra di analisi preriempita e una cartuccia capillare a 25 canali
Termociclatore 3000G	Techne	FTC3G/02	Abbiamo usato questo termocilcero per riscaldare la miscela del campione
Kit di rilevamento anti-mouse	ProteinSimple	Codice 042-205	Include anticorpo secondario coniugato HRP, tampone, reagente luminol, marcatore di peso molecolare
Anticorpo anti-P(S409-410) TDP-43	ProteinTech	22309-1-AP	Anticorpo primario che riconosce la TDP-43 fosforilata
Anticorpo anti-P(S409-412) TDP-43	CosmoBio-Stati Uniti	PUNTA-PTD-P02	Anticorpo primario che riconosce la TDP-43 fosforilata
Kit di rilevamento anti-coniglio	ProteinSimple	DM-001	Include anticorpo secondario coniugato HRP, tampone, reagente luminol, marcatore di peso molecolare
Anticorpo anti-TDP-43 (pan)	ProteinTech	10782-2-AP	Anticorpo primario che riconosce l'intera proteina TDP-43
Smembratore sonico; Modello100	Fisher Scientifico		Sonicatore. Utilizzato per rompere la membrana cellulare. Questo modello è fuori produzione (Modello XL2000-350)
Centrifuga da tavolo	Eppendorf	22625004	Modello# 5810 con benna a piastra oscillante
Analizzatore Wes	ProteinSimple	55892-WS-2203	Esegue l'elettroforesi su gel capillare
Bussola per SimpleWestern (SW)	ProteinSimple	Ver.4.0.0.	Compass for SW è l'applicazione di controllo e analisi dei dati per gli strumenti SimpleWestern