Un test immunologico basato su nanoparticelle magnetiche utilizzando un dispositivo microfluidico

1. Preparazione del dispositivo

1. Riempire i canali con acqua distillata utilizzando una siringa. Assicurarsi che non vi siano perdite o resistenza al flusso. Immergere il dispositivo in un bagno a ultrasuoni per 10 minuti per rimuovere eventuali residui di acrilico, adesivo o materiale indesiderato all'interno dei canali.
2. Svuotare l'acqua all'interno dei canali del dispositivo. Utilizzare una siringa per introdurre una soluzione bloccante preparata con il 5% (p/v) di albumina sierica bovina (BSA) diluita in 1x soluzione salina tamponata con Tris (TBS) e precedentemente filtrata attraverso un filtro per siringa in polietersulfone (PES) da 0,2 μm.
3. Preparare una sospensione di microparticelle di ferro di 7,5 μm di diametro al 5% BSA.
   nota: Le microparticelle sono state precedentemente funzionalizzate con uno strato di silice-polietilenglicole (PEG) che conferisce resistenza all'assorbimento delle proteine.
4. Incubare il chip e la sospensione di microparticelle con la soluzione bloccante per almeno 1 ora a temperatura ambiente. Se possibile, lasciare bloccare per una notte a 4 °C.

2. Formazione di trappole per microparticelle

1. Inserire le microparticelle nel chip con un ago da siringa attraverso il tubo di uscita del canale laterale. Posiziona il chip verticalmente e lascia che le microparticelle fluiscano sotto l'effetto della gravità attraverso il canale laterale. Ruotare il chip di 180° in due passi di 90° e lasciare che le microparticelle mirino e si comprimano alla restrizione di 5 μm.
2. Rimuovere le microparticelle in eccesso ruotando per gravità di 45° verso il canale laterale.
3. Tenere il dispositivo in posizione verticale per evitare di svitare la trappola per microparticelle. Vedere la Figura 1B per un riepilogo del processo di formazione delle trappole per microparticelle.

3. Immunodosaggio

1. Preparazione di nanoparticelle
   1. Prelevare 2 μL della sospensione di nanoparticelle da 100 nm precedentemente coniugate con lisozima (modello antigenico). Aggiungerlo a una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL con 100 μL di soluzione bloccante. Incubare per una notte a 4 °C.
   2. Aggiungere 150 μl di tampone di lavaggio (1x TBS, 0,05% Tween 20).
   3. Posizionare la provetta per microcentrifuga da 1,5 mL in un separatore magnetico. Tenere per 15 minuti per consentire la separazione delle nanoparticelle (Figura 2).
      nota: Il volume minimo per il separatore magnetico è di 200 μl. Evitare di utilizzare un volume inferiore.
   4. Rimuovere il liquido dalla provetta con una micropipetta. Evitare il contatto con la parete del tubo dove si è formato il pellet di nanoparticelle.
   5. Aggiungere 250 μl di tampone di lavaggio fresco. Tenere il tubo in agitazione per 15 minuti.
   6. Ripetere i passaggi 3.1.3.-3.1.5. Altre 2 volte, agitando solo per 5 minuti.
   7. Aggiungere la concentrazione desiderata di anticorpo primario anti-lisozima (vedere la Tabella dei materiali). Regolare a un volume finale di 100 μl di diluente per anticorpi (1x TBS, 1% BSA, 0,05% Tween 20).
   8. Incubare per 15 minuti a 37 °C. Continuare ad agitare per altri 15 minuti a temperatura ambiente.
   9. Ripetere le fasi di lavaggio 3.1.2.-3.1.6.
   10. Aggiungere 100 μl di diluente per anticorpi. Aggiungere l'anticorpo secondario accoppiato a perossidasi di rafano (HRP-AbII) (vedere la Tabella dei materiali) a una diluizione di 1:500.
   11. Ripetere le fasi di lavaggio 3.1.2.-3.1.6.
   12. Mantenere le nanoparticelle in un volume finale di 50 μL di diluente per anticorpi.

4. Montaggio sperimentale

1. Riempire le due siringhe di vetro da 100 μL con acqua, collegare un tubo lungo 6,5 cm a ciascuna siringa, inserire un perno di metallo all'estremità del tubo e posizionare entrambe le siringhe sulla pompa a siringa controllata da computer.
2. Sigillare tutti i tubi flessibili del dispositivo acrilico con il calore.
3. Tagliare il tubo di alimentazione e mantenerlo solo di pochi millimetri. Riempire l'ago di erogazione con il tampone di lavaggio e inserirlo nel tubo di taglio. Lasciare gocciolare la soluzione prima di collegare l'ago al dispositivo per impedire l'accesso dell'aria al dispositivo.
4. Tagliare il tubo di uscita dal canale laterale. Collegare alla pompa a siringa. Quindi, eseguire la stessa procedura per il tubo flessibile di uscita del canale principale.
   nota: È fondamentale eseguire i passaggi 4.3.-4.4. in questo modo per evitare di disimballare la trappola per microparticelle. Se possibile, verificare lo stato della trappola durante questi passaggi con l'aiuto di una lente d'ingrandimento.
5. Posizionare un vetrino sul tavolino del microscopio. Attacca il magnete alla diapositiva con del nastro biadesivo e posiziona un piccolo pezzo di nastro adesivo su ciascun lato per fissare i bordi del chip al vetro.
6. Impostare una portata di 50 μL/h attraverso le schede Portata e Unità nel controller della pompa a siringa. Selezionare la modalità di prelievo e fare clic sul pulsante Start per attivare il flusso del buffer di lavaggio.
7. Con cautela, avvicinare il dispositivo al vetrino con il magnete in modo orizzontale in modo che l'area del chip contenente la trappola entri in contatto con il magnete.
8. Incollare i bordi del dispositivo al vetro con del nastro biadesivo per evitare movimenti. Evitare di ostruire il percorso ottico per la microscopia (Figura 1C).

5. Immunorilevamento

1. Mantenere il tampone di lavaggio in flusso per 10 minuti a 50 μL/h per rimuovere l'eccesso di BSA.
2. Rimuovere il tampone di lavaggio rimanente dall'ago di erogazione con una micropipetta. Aggiungere 50 μl della sospensione di nanoparticelle.
3. Far fluire la sospensione di nanoparticelle per 7 minuti a una velocità di flusso di 100 μL/h. Successivamente, modificare la portata a 50 μL/h e fluire per altri 15 minuti.
4. Sostituire l'ago di erogazione. Far scorrere il tampone di lavaggio per 10 minuti a 50 μL/h. Preparare il substrato fluorogenico secondo le specifiche del produttore durante la fase di lavaggio.
5. Rimuovere il tampone di lavaggio rimanente dall'ago di erogazione con una micropipetta. Aggiungere 100 μl di substrato fluorogenico (vedere la Tabella dei materiali). Far scorrere il substrato fluorogenico per 6 minuti a 50 μL/h.
6. Impostare i parametri di misurazione della portata (1 μL/h, 3 μL/h, 5 μL/h e 10 μL/h) e del tempo (6 min) nelle schede Portata e Timer corrispondenti dell'interfaccia che controlla la pompa a siringa. Assicurarsi di selezionare la modalità di ritiro per ciascuna delle misurazioni da eseguire.
7. Impostare una linguetta aggiuntiva della portata a 50 μl/h e impostare il timer a 3 minuti per la fase di lavaggio.
8. Accendere la fluorescenza del microscopio 15 s prima che il substrato a 50 μL/h si fermi. Avviare l'acquisizione dell'immagine con il software della fotocamera del microscopio 10 secondi prima che il substrato si fermi con un tempo di esposizione di 1.000 millisecondi. Eseguire l'imaging per 6 minuti a 1 fotogramma/s (FPS).
9. Fare clic sul pulsante Avvia del parametro di portata desiderato subito dopo l'arresto della portata di lavaggio del substrato a 50 μL/h. Fare clic sul pulsante Avvia del flusso di lavaggio (50 μL/h) subito dopo l'arresto del flusso di misura selezionato.
10. Interrompere l'acquisizione dell'immagine e disattivare la fluorescenza del microscopio per evitare il fotosbiancamento del substrato.
11. Ripetere i passaggi 5.8.-5.10. per ogni portata di misura utilizzata.

Figura 1: Configurazione finale del dispositivo. (A) Dispositivo acrilico con i tubi flessibili collegati agli ingressi e alle uscite corrispondenti. La scala mostra le dimensioni del dispositivo in centimetri. (B) Protocollo per la formazione della trappola per microparticelle. Le microparticelle fluiscono attraverso il canale per gravità quando il dispositivo è posizionato in posizione verticale. Le microparticelle sono concentrate alla restrizione di 5 μm. Le microparticelle in eccesso vengono facilmente rimosse ruotando il chip attraverso il canale laterale. Il chip viene mantenuto verticale per preservare la trappola prima dell'immunodosaggio. (C) Dispositivo microfluidico montato su un vetrino contenente il magnete, sul tavolino del microscopio a fluorescenza invertita. Si osserva l'ago di erogazione attraverso il quale vengono aggiunti i reagenti, così come i tubi di uscita che si collegano a una pompa a siringa.

Figura 2: Separazione delle nanoparticelle. Utilizzando un separatore magnetico commerciale, le nanoparticelle da 100 nm possono essere facilmente concentrate per eseguire le fasi di lavaggio durante l'immunodosaggio. Il pallino formatosi dopo 15 minuti si osserva nel cerchio rosso.