Un metodo basato sull'immunofluorescenza per quantificare lo stress di replicazione nelle cellule tumorali

Abstract

Fonte: Ramakrishnan, N. et al., Quantificazione dello stress di replicazione nelle cellule di cancro ovarico utilizzando l'immunofluorescenza del DNA a singolo filamento.J. Vis. Exp. (2023)

Il video dimostra un approccio basato sull'immunofluorescenza per quantificare lo stress di replicazione nelle cellule tumorali. Le cellule trattate con idrossiurea producono DNA a filamento singolo, rilevato attraverso l'immunofluorescenza. Il conteggio dei focolai di fluorescenza verdi indica il livello di stress di replicazione nelle cellule tumorali.

Protocol

NOTA: La linea cellulare di cancro ovarico, OVCAR3, è stata utilizzata in questi passaggi, ma questo protocollo è ampiamente applicabile a molte altre linee cellulari, comprese quelle derivate da fonti non ovariche. Uno schema del protocollo è mostrato nella Figura 1.

1. Placcatura delle celle

1. Realizzare vetrini coprioggetti rivestiti di poli-L-lisina.
   1. Aggiungere vetrini coprioggetti autoclavati di 12 mm di diametro a una provetta conica da 50 ml con soluzione di poli-L-lisina e posizionarli su un bilanciere per 15 minuti.
   2. Aspirare la soluzione in una capp....

Results

Figura 1: Schema di etichettatura IdU.Le cellule vengono pulsate con IdU per due raddoppi della popolazione. Se è necessario un trattamento farmacologico, dovrebbe essere somministrato dopo il primo raddoppio della popolazione in presenza di IdU.

Figura 2: Conf.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3% Paraformaldeide (PFA)	Fisher Scientifico	NC0179595	10 g di saccarosio + 100 mL di PBS 10X + acqua per un volume di 925 mL. Aggiungere 75 mL di PFA senza metanolo al 40%, mescolare e fare aliquote da 50 mL prima di riporre Conservazione: Conservare a -20 °C
5-iodo-2'-deossiuridina (IdU)	Sigma Aldrich	I7125-5G	MW = 354,10 g/mol. Per 10 mM di brodo: sciogliere 3,541 mg di IdU in 1 mL di ammoniaca liquida 1 N
Anticorpo anti-BrdU	BD Bioscienze	Telefono 347580	Conservazione: Conservare a 4 °C
Anticorpo secondario Alexa Fluor Plus 488 anti-topo	Termo Scientifico	A32766	Sensibile alla luce - mantenere al buio
Albumina sierica bovina (BSA)	Sigma Aldrich	A7906-100G	Realizzato aggiungendo massa specifica al volume di PBS Conservazione: Conservare a 4 °C
Vetro di copertura circolare	Scienze della microscopia elettronica	Codice: 72230-01
OVCAR3	ATCC	HTB-161	Terreni di crescita: RPMI integrato con L-glutammina, 0,01 mg/mL di insulina bovina; siero fetale bovino a una concentrazione finale del 20% e 1X Pen Strep Conservazione: Terreni di congelamento: terreno di coltura + 5% DMSO e conservati a -80 °C
Soluzione di poli-L-lisina	Sigma Aldrich	P4832-50ML	Conservazione: Conservare a 4 °C
ProLong Diamond Antifade Mountant con DAPI	Termo Scientifico	P36962	Conservazione: Conservare a 4 °C
Tripsina-EDTA, 0,25%	Genesee Scientifico	25-510	Conservazione: Conservare a 4 °C
Acqua, filtrata sterile	Sigma Aldrich	W3500-6X500ML	Conservazione: Conservare a 4 °C