Un metodo basato sull'immunofluorescenza per quantificare lo stress di replicazione nelle cellule tumorali

Abstract

Fonte: Ramakrishnan, N. et al., Quantificazione dello stress di replicazione nelle cellule di cancro ovarico utilizzando l'immunofluorescenza del DNA a singolo filamento.J. Vis. Exp. (2023)

Il video dimostra un approccio basato sull'immunofluorescenza per quantificare lo stress di replicazione nelle cellule tumorali. Le cellule trattate con idrossiurea producono DNA a filamento singolo, rilevato attraverso l'immunofluorescenza. Il conteggio dei focolai di fluorescenza verdi indica il livello di stress di replicazione nelle cellule tumorali.

Protocollo

NOTA: La linea cellulare di cancro ovarico, OVCAR3, è stata utilizzata in questi passaggi, ma questo protocollo è ampiamente applicabile a molte altre linee cellulari, comprese quelle derivate da fonti non ovariche. Uno schema del protocollo è mostrato nella Figura 1.

1. Placcatura delle celle

1. Realizzare vetrini coprioggetti rivestiti di poli-L-lisina.
   1. Aggiungere vetrini coprioggetti autoclavati di 12 mm di diametro a una provetta conica da 50 ml con soluzione di poli-L-lisina e posizionarli su un bilanciere per 15 minuti.
   2. Aspirare la soluzione in una cappa per coltura tissutale. Lavare i vetrini coprioggetti aggiungendo acqua sterile e riposizionare il tubo contenente i vetrini coprioggetti sul bilanciere per 5 minuti. Ripetere questa fase di lavaggio tre volte.
   3. Stendere i vetrini coprioggetti rivestiti su un piatto sterile e aspirare l'acqua rimanente. Lasciare asciugare i vetrini nella cappa di coltura tissutale per 1 ora o fino a quando non rimangono goccioline d'acqua. Una volta asciutto, sigillare la pirofila con parafilm e posizionarla a 4 °C.
2. Posizionare un vetrino coprioggetti rivestito di poli-L-lisina in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. L'uso di vetrini coprioggetti in polilisina è fondamentale per prevenire il distacco delle cellule dai vetrini coprioggetti durante la fase di pre-estrazione.
3. Tripsinizzare le cellule OVCAR3 una volta raggiunta la confluenza del 70%-80%.
   1. Per tripsinizzare una piastra di coltura di 10 cm confluente al 70%-80%, aspirare il terreno dalla piastra e lavare con 5-7 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
   2. Aspirare il PBS, aggiungere 1 mL di tripsina allo 0,25% e posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 °C per 8-10 minuti, o fino a quando le cellule non si staccano dal fondo della piastra.
   3. Raccogliere le cellule con 5-10 mL di terreno e aggiungerle in una provetta conica.
   4. Contare le cellule manualmente con un emocitometro utilizzando le procedure standard.
4. Effettuare una diluizione di 25.000 cellule/mL e aggiungere 1 mL di cellule su vetrini coprioggetti in poli-L-lisina posti nei pozzetti delle piastre a 24 pozzetti. Per qualsiasi altra linea cellulare, determinare un numero tale che le cellule siano circa il 70%-80% confluenti dopo tre raddoppi della popolazione.
5. Far crescere le cellule nel terreno di coltura in condizioni standard.

2. Celle pulsanti con IdU

1. Affinché le cellule si diffondano correttamente sui vetrini, è sufficiente un raddoppio della popolazione. Dopo un raddoppio della popolazione, pulsare le cellule con 10 μM di 5-iodo-2'-deossiuridina (IdU) (vedi Tabella dei materiali su come ricostituire l'IdU) per i due successivi raddoppi della popolazione.
   nota: Abbiamo provato diversi analoghi della timidina, tra cui la bromodeossiuridina (BrdU), la 5-cloro-2'-deossiuridina (CIdU) e l'IdU. Tra i tre analoghi, IdU offre il miglior rapporto segnale/rumore. Le immagini comparative delle cellule pulsate con i tre diversi analoghi sono mostrate nella Figura 2. Si raccomanda l'uso di due controlli negativi: (i) un campione pulsato senza IdU e (ii) un controllo senza anticorpi primari. Se la formazione di ssDNA deve essere valutata a causa di un determinato trattamento, si consiglia di aggiungere il farmaco dopo il primo ciclo di raddoppio dell'IdU.
2. Dopo aver pulsato con IdU per due raddoppi della popolazione, raccogliere le cellule per l'imaging.
   1. Sostituire il terreno con 0,5% PBSTx ghiacciato (PBS + 0,5% Triton X-100) su ghiaccio per 5 minuti. Questa fase di pre-estrazione aiuta a rilasciare proteine citoplasmatiche e non legate alla cromatina, lasciando intatte le proteine legate alla cromatina. Alcune linee cellulari possono facilmente staccarsi durante la pre-estrazione. In tale scenario è possibile utilizzare tampone CSK allo 0,5% (10 mM PIPES (pH 6,8), 100 mM di cloruro di sodio (NaCl), 300 mM di saccarosio, 3 mM di cloruro di magnesio (MgCl₂), 1 mM di acido etilenglicole tetraacetico (EGTA) e 0,5% di Triton X-100).

3. Fissazione

1. Aspirare PBSTx e incubare per 15 minuti con paraformaldeide (PFA) al 3% (Tabella dei materiali) a temperatura ambiente, seguito da tre o quattro lavaggi con 1x PBS. Le celle fisse possono essere mantenute a 4 °C fino a ulteriori passaggi.
   ATTENZIONE: Il PFA è altamente tossico e cancerogeno. Evitare il contatto con la pelle, gli occhi e le mucose. Eseguire tutti i passaggi con PFA in una cappa aspirante e smaltire correttamente i materiali.

4. Permeabilizzazione e blocco

1. Dopo la fissazione, permeabilizzare le cellule utilizzando PBSTx allo 0,5% su ghiaccio per 5 minuti. Utilizzare un volume sufficiente a coprire l'intero vetrino coprioggetti (in genere tra 500 μl e 1 mL).
2. Lavare le celle tre o quattro volte con 0,2% PBST (1X PBS + 0,2% Tween-20) a temperatura ambiente. Un ml di PBST è sufficiente per lavare ogni pozzetto. Eseguire i lavaggi uno dopo l'altro senza incubazioni.
3. Aspirare il PBST e bloccare i campioni utilizzando albumina sierica bovina al 5%, BSA (Table of Materials) prodotta in 1x PBS (tampone bloccante) per 30 minuti a temperatura ambiente.

5. Immunocolorazione con l'anticorpo IdU

1. Per l'immunocolorazione, preparare una camera umidificata (tovagliolo di carta bagnato su un Tupperware a fondo piatto). Coprire il coperchio della piastra a 24 pozzetti con parafilm, posizionarlo nella camera umidificata e stendere i vetrini coprioggetti sul coperchio della piastra.
2. Preparare l'anticorpo primario di topo anti-BrdU (Tabella dei materiali) diluindolo 1:200 nel tampone bloccante del passaggio 4.2. L'anticorpo anti-BrdU ha precedentemente dimostrato di rilevare l'IdU.
3. Aggiungere 60 μl di diluizione dell'anticorpo IdU sulla parte superiore dei vetrini. Incubare i vetrini coprioggetti per 1 ora a 37 °C.
   1. In alternativa, utilizzare meno soluzione di anticorpi se i vetrini coprioggetti vengono capovolti su una goccia (20-25 μl) di diluizione di anticorpi 1:200 pipettata su parafilm. Ciò riduce anche la probabilità che la soluzione si asciughi durante l'incubazione.
4. Dopo l'incubazione di 1 ora, aspirare l'anticorpo primario. Rimetti i vetrini coprioggetti in una piastra a 24 pozzetti e lavali quattro volte con PBST allo 0,2%.
5. Per l'anticorpo secondario, utilizzare la stessa camera umidificata descritta al punto 5.1. Diluire l'anticorpo secondario coniugato anti-topo (Tabella dei materiali) nel tampone bloccante (1:200). Aggiungere 60 μL di anticorpo secondario ai vetrini coprioggetti e incubare a temperatura ambiente al buio per 1 ora. Questo anticorpo secondario è sensibile alla luce.
6. Aspirare l'anticorpo secondario. Rimettere i vetrini coprioggetti nella piastra a 24 pozzetti e lavare quattro volte con PBST allo 0,2%.
7. Etichettare i vetrini del microscopio e montare i vetrini coprioggetti sui vetrini con il mezzo di montaggio 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) (Tabella dei materiali). Conservare i vetrini al buio a temperatura ambiente per 24 ore. L'incubazione di 24 ore è consigliata se il mezzo di montaggio deve essere indurito o indurito.
   nota: I vetrini possono quindi essere conservati a 4 °C prima di essere ripresi con un microscopio a fluorescenza. Un'immagine rappresentativa è mostrata nella Figura 3.

Risultati

Figura 1: Schema di etichettatura IdU.Le cellule vengono pulsate con IdU per due raddoppi della popolazione. Se è necessario un trattamento farmacologico, dovrebbe essere somministrato dopo il primo raddoppio della popolazione in presenza di IdU.

Figura 2: Conf...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
3% Paraformaldeide (PFA)	Fisher Scientifico	NC0179595	10 g di saccarosio + 100 mL di PBS 10X + acqua per un volume di 925 mL. Aggiungere 75 mL di PFA senza metanolo al 40%, mescolare e fare aliquote da 50 mL prima di riporre Conservazione: Conservare a -20 °C
5-iodo-2'-deossiuridina (IdU)	Sigma Aldrich	I7125-5G	MW = 354,10 g/mol. Per 10 mM di brodo: sciogliere 3,541 mg di IdU in 1 mL di ammoniaca liquida 1 N
Anticorpo anti-BrdU	BD Bioscienze	Telefono 347580	Conservazione: Conservare a 4 °C
Anticorpo secondario Alexa Fluor Plus 488 anti-topo	Termo Scientifico	A32766	Sensibile alla luce - mantenere al buio
Albumina sierica bovina (BSA)	Sigma Aldrich	A7906-100G	Realizzato aggiungendo massa specifica al volume di PBS Conservazione: Conservare a 4 °C
Vetro di copertura circolare	Scienze della microscopia elettronica	Codice: 72230-01
OVCAR3	ATCC	HTB-161	Terreni di crescita: RPMI integrato con L-glutammina, 0,01 mg/mL di insulina bovina; siero fetale bovino a una concentrazione finale del 20% e 1X Pen Strep Conservazione: Terreni di congelamento: terreno di coltura + 5% DMSO e conservati a -80 °C
Soluzione di poli-L-lisina	Sigma Aldrich	P4832-50ML	Conservazione: Conservare a 4 °C
ProLong Diamond Antifade Mountant con DAPI	Termo Scientifico	P36962	Conservazione: Conservare a 4 °C
Tripsina-EDTA, 0,25%	Genesee Scientifico	25-510	Conservazione: Conservare a 4 °C
Acqua, filtrata sterile	Sigma Aldrich	W3500-6X500ML	Conservazione: Conservare a 4 °C