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Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Fabbricazione e stoccaggio di chip a scatto
- Metodo di trasferimento singolo (Figura 1a)
- Individuare soluzioni di cAb contenenti 400 μg/mL di anticorpi e glicerolo al 20% in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) su un vetrino di nitrocellulosa (o un vetro funzionalizzato) con uno spotter di microarray a getto d'inchiostro a un'umidità relativa del 60% (1,2 nL per ogni spot) con una spaziatura da centro a centro di 800 μm. Assicurarsi che il carrello sia fissato sul ponte di osservazione secondo un angolo (in questo caso è stato utilizzato l'angolo in basso a sinistra).
- Incubare il vetrino del saggio spotted a temperatura ambiente per 1 ora con un'umidità relativa del 60%.
- Fissare una guarnizione del modulo di scorrimento con 16 scomparti sul vetrino del saggio per dividerlo in 16 pozzetti. Sciacquare il vetrino tre volte aggiungendo 80 μl di PBS contenente lo 0,1% di Tween-20 (PBST) in ciascun pozzetto e agitando a 450 giri/min su un agitatore, 5 minuti ogni volta.
- Aggiungere 80 μl di soluzioni bloccanti a ciascun pozzetto e agitare per 1 ora a 450 giri/min.
- Rimuovere la guarnizione e asciugare il vetrino di analisi con un getto di azoto.
- Fissare una diapositiva di trasferimento sul deck spotter e spingere l'angolo inferiore sinistro della slitta contro l'angolo inferiore sinistro del deck spotter. Il getto d'inchiostro individua una serie di segni di allineamento (una soluzione di microsfere di polistirene) con lo stesso layout di quello per gli anticorpi di cattura (cAb).
- Lasciare asciugare i segni di allineamento. Capovolgere la slitta di trasferimento e rimetterla sul ponte spotter, fissandola contro l'angolo in basso a sinistra.
- Preparare le soluzioni di spotting per anticorpi di rilevamento (dAb) contenenti 20 μg/mL di anticorpi, 20% di glicerolo e 1% di albumina sierica bovina (BSA).
- Utilizzando la fotocamera dell'osservatore, scattare una foto di un segno di allineamento. Implementa questa immagine nel programma di spotting come fiduciale e ottieni il sistema di riconoscimento delle immagini dello spotter a getto d'inchiostro per identificare il segno in alto a sinistra. Utilizzare la sua coordinata come primo punto dell'array dAb. Spot 8 nL per goccia con una spaziatura da centro a centro di 800 μm.
- Metodo del doppio trasferimento (Figura 1b)
- Posizionare una diapositiva di trasferimento 1 sul piatto di rilevamento a getto d'inchiostro contro l'angolo in basso a sinistra. Posizionare le soluzioni di cAbs contenenti 400 μg/mL di anticorpi, il 20% di glicerolo e l'1% di BSA in PBS sul vetrino con uno spotter di microarray a getto d'inchiostro a un'umidità relativa del 60% (0,4 nL per ogni punto e ~ 200 μm di diametro). La distanza da centro a centro è di 400 μm.
- Agganciare il vetrino di trasferimento con un vetrino di saggio rivestito di nitrocellulosa (o un vetrino funzionalizzato) utilizzando un apparecchio a scatto (Figura 2) per trasferire le goccioline di cAb sul vetrino di saggio.
- Ruotare tutti e sei i pulsanti sul lato dell'apparecchio a scatto di 90 gradi per tirare e bloccare tutti gli stantuffi in posizione aperta. Inserire il vetrino di trasferimento nel supporto del vetrino nel suo alloggiamento con l'angolo agganciato rivolto verso il perno pogo fisso. Ruota la prima serie di tre pulsanti per rilasciare gli stantuffi con il perno pogo dorato e assicurati che le diapositive siano spinte contro i perni di allineamento.
- Inserire un vetrino rivestito di nitrocellulosa nell'apparecchio a scatto capovolto appoggiato sui 4 perni pogo. Ruotare la seconda serie di tre pulsanti per rilasciare gli stantuffi con il perno d'argento e assicurarsi che i vetrini siano spinti contro i perni di allineamento.
- Chiudere l'apparecchio a scatto posizionando il guscio superiore sul supporto della slitta utilizzando le colonne di allineamento e i fori per un posizionamento preciso.
- Inserire l'apparecchio a scatto chiuso nella sua gabbia e spingere la linguetta di chiusura completamente verso il basso per portare i microarray faccia a faccia applicando la pressione appropriata. Conservare chiuso per 1 minuto.
- Separare le diapositive. Incubare il vetrino del saggio a temperatura ambiente per 1 ora con un'umidità relativa del 60%. Lavare, bloccare e asciugare il vetrino del saggio come descritto nei passaggi 1.1.3 - 1.1.5.
- Posizionare un'altra diapositiva di trasferimento sul piatto di spotter a getto d'inchiostro e spingere contro l'angolo in basso a sinistra. Spot dAb contenenti 50 o 100 μg/mL di anticorpi (vedi Tabella 1), 20% di glicerolo e 1% di BSA in PBS. Assicurarsi che ogni punto sia di 0,8 nL e che la distanza da centro a centro tra i punti sia di 400 μm.
- Conservare il test e il vetrino di trasferimento. Sigillare i vetrini di analisi e di trasferimento in un sacchetto ermetico contenente essiccante e metterli in congelatore a -20 °C.
2. Immunodosaggi multiplexati con chip snap
- Recuperare il vetrino del test dal congelatore. Lasciare il sacchetto sigillato per 30 minuti fino a quando il vetrino non raggiunge la temperatura ambiente.
- Preparare soluzioni di campioni diluiti seriali a 7 punti aggiungendo proteine in PBS contenenti lo 0,05% di Tween-20.
nota: In questo caso, viene utilizzato un fattore di diluizione di 5 volte. Le concentrazioni iniziali per ciascuna proteina sono elencate nella Tabella 1.
- Preparare le soluzioni campione in base alle esigenze. Ad esempio, diluire il siero umano 4 volte in tampone PBST.
- Fissare una guarnizione a 16 scomparti sul vetrino del saggio.
- Riempire una colonna di 8 pozzetti con le 7 soluzioni di diluizione proteica e una soluzione tampone PBST priva di proteine mediante pipettaggio. Pipettare le soluzioni campione negli altri 8 pozzetti sullo stesso vetrino.
NOTA: In ogni pozzetto possono essere inserite soluzioni da 80 μl. È possibile utilizzare più vetrini per misurare campioni aggiuntivi quando necessario.
- Incubare i campioni su un agitatore a 450 giri/min per 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 °C. Lavare il vetrino tre volte con PBST sull'agitatore a 450 giri/min, 5 minuti ogni volta. Rimuovere la guarnizione e asciugare il vetrino sotto un getto di azoto gassoso.
- Recuperare il vetrino di trasferimento con i dAb dal congelatore. Conservare il sacchetto sigillato per 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi, incubare il vetrino in una camera chiusa (ad es. scatola di puntali vuota) contenente il 60% di perle di stabilizzazione dell'umidità per 20 minuti per la reidratazione.
- Agganciare il vetrino di trasferimento con il vetrino del saggio utilizzando un apparecchio a scatto (Figura 2) per trasferire le goccioline di dAb. Vedere la sezione 1.2.2 per il funzionamento dell'apparecchio a scatto.
- Separare le diapositive. Incubare il vetrino del saggio in una camera chiusa contenente il 60% di perle di stabilizzazione dell'umidità per 1 ora. Bloccare il vetrino con una guarnizione a 16 scomparti e sciacquare il vetrino 4 volte utilizzando PBST su un agitatore a 450 giri/min, 5 minuti ogni volta.
- Pipettare 80 μL di soluzioni contenenti 2,5 μg/mL di streptavidina fluoroforo in PBS in ciascun pozzetto. Incubare per 20 minuti su uno shaker a 450 giri/min.
- Sciacquare il vetrino 3 volte con PBST e una volta con acqua distillata sullo shaker a 450 giri/min. Rimuovere la guarnizione e asciugare la slitta utilizzando gas azoto.
3. Scansione dei vetrini e analisi dei dati
- Scansiona il vetrino del saggio con uno scanner a fluorescenza per microarray utilizzando il laser a 635 nm.
- Estrarre l'intensità netta di ogni spot utilizzando un software di analisi (ad es. analizzatore array-pro).
- Calcola il limite di rilevazione (LOD) di ciascuna proteina utilizzando un software di statistica e determina le concentrazioni proteiche nei campioni.
nota: Il LOD è definito come l'intercetta Y della curva standard incrementata di tre volte la deviazione standard di tre saggi indipendenti.
Tabella 1. Concentrazioni proteiche e LOD nel tampone dal saggio a 50 plessi. Il LOD per CA 15-3 è espresso in U/ml (*).
| Nome della proteina | Concentrazione iniziale (ng/ml) | LOD (pg/ml) | Nome della proteina | Concentrazione iniziale (ng/ml) | LOD (pg/ml) |
| ANG2 | 500 | 1.3 × 104 | IL-6b | 1 | 2.1 × 102 |
| BDNF | 500 | 1.0 × 102 | IL-5 | 50 | 77 |
| CA 15-3* | 1 | 4.9 × 103 | IL-4 | 1000 | 1.5 × 104 |
| Cea | 1000 | 5.4 × 103 | IL-2 | 50 | 76 |
| CXCL10/IP-10 | 50 | 1.7 × 102 | Lep | 200 | 4.0 × 102 |
| Crp | 200 | 44 | Mig | 500 | 11 × 102 |
| Ita | 1000 | 6.2 × 102 | CCL3/MIP-1α | 50 | 3.3 |
| FEG | 50 | 1.8 × 102 | CCL4/MIP-1β | 50 | 12 |
| Emissioni di gas serra | 200 | 1.9 × 102 | MMP-3 | 500 | 1.0 × 102 |
| FAS-L | 500 | 4.5 × 102 | M-CSF | 500 | 8.2 × 103 |
| FGF | 500 | 1.0 × 103 | MMP-9 | 200 | 3.1 × 102 |
| G-CSF | 500 | 39 | CCL2/MCP-1 | 50 | 55 |
| GM-CSF | 50 | 3.8 | NCAM-1 | 500 | 1.7 × 103 |
| GRO-α | 50 | 3.0 × 102 | β-NGF | 200 | 1.4 × 103 |
| HER2 | 500 | 3.5 × 103 | NT-3 | 200 | 5.8 × 102 |
| PDGF-BB | 200 | 73 | OPN | 500 | 1.9 × 103 |
| IL-1β | 500 | 7.9 × 102 | RBP4 | 200 | 1.2 ×102 |
| IL-1ra | 200 | 1.1 × 103 | Sparc | 1000 | 4.6 ×104 |
| IL-15 | 50 | 8.2 × 102 | TNF-α | 50 | 4.4 |
| IL-12 | 1 | 30 | TNF-RI | 50 | 1.3 × 102 |
| IL-11 | 500 | 1.2 × 103 | TNF-RII | 50 | 12 |
| IL-10 | 500 | 6.1 ×102 | FAS/TNFRSF6 | 200 | 2.8 ×102 |
| IL-8 | 50 | 6.6 | uPA | 200 | 24 |
| IL-7 | 2.5 | 26 | uPAR(CD87) | 200 | 76 |
| IL-6a | 1000 | 84 | VEGF | 200 | 6,7 × 102 |
