Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Colorazione con il primo anticorpo
- Decerare e reidratare i vetrini inclusi in paraffina fissati in formalina (FFPE) con 5 minuti assegnati a ciascuna delle seguenti fasi: xilene o reagenti equivalenti 3x, 100% etanolo 2x, 95% etanolo 1x, 70% etanolo 1x, 50% etanolo 1x e acqua distillata 2x.
nota: I vetrini devono rimanere umidi a partire da questa fase di reidratazione fino al montaggio nella fase finale.
- Per il recupero opzionale dell'antigene, posizionare i vetrini in 275 mL di soluzione bollente di citrato di sodio (10 mM, pH = 6,0) per 8 minuti. Per mantenere la soluzione in ebollizione, posizionare i vetrini sul fondo di una scatola di puntali per pipette di14 x 9,5 x 9 cm 3 (L x L x A) con coperchio e cuocere la soluzione nel microonde al 70% di potenza in un forno a microonde da 700 W per 8 minuti. Quindi rimuovere la scatola del puntale della pipetta dal forno a microonde, aprire il coperchio e lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente (RT) per almeno 20 minuti.
- Trasferire i vetrini in un barattolo Coplin contenente PBST (soluzione salina tamponata con fosfato con polisorbato 20/80 allo 0,1%). Lavare con PBST per 5 minuti 3 volte. Se non si passa immediatamente alla fase successiva, conservare i vetrini in questa fase con PBST in un barattolo Coplin a RT per alcune ore o a 4 °C per 1-2 giorni, se non si passa immediatamente alla fase successiva.
- Per preparare la soluzione bloccante, utilizzare il siero normale della specie ospite dell'anticorpo secondario come reagente bloccante. Possono essere utilizzati anche altri reagenti bloccanti commerciali. Se si utilizza il siero normale impiegato per lo studio presentato in questo studio, aggiungere 100 μL di siero d'asino normale a 4,9 mL di PBST. La soluzione bloccante può essere conservata a 4 °C per un massimo di 3 giorni.
- Per il blocco, scuotere il PBST dai vetrini e coprirli rapidamente con una quantità sufficiente di soluzione bloccante. Incubare i vetrini a RT in una camera umidificata per 30 minuti.
- Preparare la soluzione di anticorpi primari (500 μl per due vetrini) utilizzando la soluzione bloccante per diluire l'anticorpo primario alla concentrazione desiderata. La soluzione deve essere conservata con ghiaccio fino al momento dell'uso.
- Per la 3β-idrossisteroide deidrogenasi (3βHSD), aggiungere 2 μL di anticorpo 3βHSD in 498 μL di soluzione bloccante.
- Per la tirosina idrossilasi (TH), aggiungere 0,5 μl di anticorpo TH in 499 μl di soluzione bloccante.
- Per la β-catenina, aggiungere 1 μL di anticorpo β-catenina in 499 μL di soluzione bloccante.
- Per la 20α-idrossisteroide deidrogenasi (20αHSD), aggiungere 1 μL di anticorpo 20αHSD in 499 μL di soluzione bloccante.
- Per il citocromo P450 2F2 (CYP2F2), aggiungere 2 μL di anticorpo CYP2F2 in 498 μL di soluzione bloccante.
- Incubare con l'anticorpo primario scrollandosi di dosso la soluzione bloccante dai vetrini e coprendoli rapidamente con una quantità sufficiente di soluzione di anticorpi primari. Incubare i vetrini in una camera umidificata per una notte a 4 °C. Durante l'incubazione i vetrini possono essere coperti da un piccolo pezzo di pellicola di paraffina per evitare che si secchino.
- La mattina successiva lavare i vetrini con PBST per 5 minuti 3 volte.
- Preparare la soluzione di anticorpi secondari (500 μl per due vetrini) utilizzando la soluzione bloccante per diluire l'anticorpo secondario biotinilato alla concentrazione desiderata (ad esempio, 1 μl di anticorpo anti-topo d'asino o anticorpo anti-coniglio d'asino in 499 μl di soluzione bloccante). La soluzione deve essere conservata con ghiaccio fino al momento dell'uso.
- Incubare con il secondo anticorpo scrollandosi di dosso il PBST dai vetrini e coprendoli rapidamente con una quantità sufficiente di soluzione di anticorpi secondari. Incubare i vetrini in una camera umidificata per 1 ora a RT.
nota: Se la biotina endogena è un problema, utilizzare un anticorpo secondario coniugato con perossidasi invece dell'anticorpo secondario biotinilato. Passare al passaggio 1.14 se si utilizza un anticorpo secondario coniugato con perossidasi nel passaggio 1.10.
- Lavare i vetrini con PBST per 5 minuti 3 volte.
- Preparare la soluzione di streptavidina coniugata con perossidasi di rafano (SA-HRP) (500 μL per due vetrini) aggiungendo 0,5 μL di SA-HRP in 499 μL di PBS. La concentrazione finale è di 1 μg/mL.
- Incubare con la soluzione SA-HRP. Scuotere il PBST dai vetrini e coprire rapidamente i vetrini con una quantità sufficiente di soluzione SA-HRP. Incubare i vetrini in una camera umidificata per 0,5 ore a RT.
- Lavare i vetrini con PBST per 5 minuti 3 volte.
- Preparare la soluzione di fluoroforo-tiramide diluendo il fluoroforo-tiramide con il suo tampone di diluizione secondo le istruzioni del produttore (ad esempio, 5 μL di fluoroforo-tiramide in 496 μL di tampone di diluizione).
- Eseguire lo sviluppo del segnale con fluoroforo-tiramide scrollandosi di dosso il PBST dai vetrini e coprendo rapidamente i vetrini con una quantità sufficiente di soluzione di fluoroforo-tiramidide. Incubare in una camera umidificata per 1 minuto a RT. Il tempo di incubazione può essere regolato per ottenere l'intensità di fluorescenza desiderata. Arrestare la reazione trasferendo i vetrini in un barattolo Coplin contenente PBST. Lavare i vetrini con PBST per 3 minuti 2x.
- I segnali possono essere controllati rapidamente con un microscopio a fluorescenza per confermare il risultato in questa fase. Se non si utilizzano vetrini coprioggetti, applicare una goccia di glicerolo:PBS (1:1) su ciascuna sezione per mantenere i campioni umidi. Lavare i vetrini con PBST per 3 minuti 2x. I vetrini possono essere conservati in PBST a 4 °C per alcuni giorni prima di passare alla fase successiva.
2. Rimuovi il primo anticorpo
- Immergere i vetrini in 275 ml di soluzione bollente di citrato di sodio (10 mM, pH = 6,0) per almeno 8 minuti. Mantenere la soluzione in ebollizione posizionando i vetrini sul fondo di una scatola di puntali per pipette da 14 x 9,5 x 9 cm3 (L x L x A) con coperchio e cuocendo la soluzione nel microonde al 70% di potenza in un forno a microonde da 700 W per 8 minuti. Se si preferisce un tempo di rimozione più lungo, potrebbe essere necessario rabboccare il tampone utilizzando una soluzione di citrato di sodio bollente per mantenere i vetrini sempre immersi nella soluzione tampone. Togliete la scatola dei puntali della pipetta dal forno a microonde, aprite il coperchio e lasciate raffreddare la soluzione a RT per almeno 20 minuti.
- Trasferire i vetrini in un barattolo Coplin contenente PBST. Lavare con PBST per 5 minuti 3 volte. Se il passaggio successivo non viene eseguito immediatamente, conservare i vetrini in un barattolo Coplin con PBST a RT per alcune ore o a 4 °C per 1-2 giorni.
3. Colora con il secondo anticorpo
- Iniziare dal passaggio di blocco e seguire le stesse procedure nei passaggi da 1.5 a 1.14. Nelle fasi di sviluppo del segnale (passaggio 1.15 e passaggio 1.16), utilizzare il fluoroforo-tiramide in un diverso spettro di fluorescenza.
nota: I vetrini possono essere rimossi più volte con questo metodo per consentire la colorazione multiplex. L'ultimo anticorpo non richiede fluoroforo-tiramide come reporter. Un anticorpo secondario coniugato con fluorofori potrebbe essere utilizzato per mostrare i segnali dell'ultimo anticorpo primario.
- Incubare i vetrini con 2 μg/mL di 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) o con una soluzione di Hoechst per 1 minuto a RT se è necessaria la controcolorazione nucleare. Quindi lavare i vetrini con PBST per 3 minuti 2x.
