Imaging a immunofluorescenza multiplexato per analizzare sottopopolazioni di cellule T resistenti all'immunoterapia

Abstract

Fonte: Granier, C., et al. Analisi e quantificazione dell'immunofluorescenza multiplexata delle cellule T intratumorali PD-1⁺ Tim-3⁺ CD8⁺. J. Vis. Exp. (2018).

Questo video dimostra una tecnica di imaging multispettrale a fluorescenza in situ per analizzare diverse sottopopolazioni di cellule T infiltranti nel tessuto tumorale. Una criosezione tissutale di carcinoma a cellule renali viene trattata con anticorpi per marcare le cellule T CD8+ che esprimono specifici recettori inibitori e mostrano un fenotipo resistente all'immunoterapia. La sezione marcata viene visualizzata utilizzando un microscopio multispettrale per identificare le distinte sottopopolazioni di cellule T CD8+.

Protocollo

Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto

1. Colorazione in immunofluorescenza in situ di linfociti infiltranti il tumore (TIL)

1. Linee guida procedurali
   1. Eseguire tutte le fasi sperimentali a temperatura ambiente.
   2. Per tutti i passaggi, eseguire le diluizioni con Tris Buffer Saline (TBS; vedere la tabella dei materiali).
   3. Eseguire il lavaggio in TBS per tutti i passaggi tranne dopo l'incubazione degli anticorpi primari. Per quest'ultimo, utilizzare Tris Buffer Sal....

Risultati

Figura 1: Immunocolorazione CD8-PD-1-Tim-3 su un tessuto incluso in paraffina tonsillare. Per la tripla immunocolorazione sono state selezionate sezioni di tessuto incluse in paraffina invece di sezioni crioconservate. Dopo la deceratura e la reidratazione, è stato applicato lo stesso protocollo di colorazione precedentemente sviluppato per le sezioni crioconservate. Le cellule T CD8+ si trovano all'.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Vectra 3 Imaging patologico quantitativo automatizzato	Perkin Elmer	CLS142338
Analisi cellulare inForm 2.1.	Perkin Elmer	CLS135781
R software	https://www.r-project.org
Penna di delimitazione Dakopen	Dako	Episodio 2002
Tris Buffer Soluzione Salina TBS Compresse	Takara, Bio Inc.	TAKT9141Z	pH7.6 100 compresse
Tris Buffer soluzione salina Tween 20 TBS (+Tween20)	Takara, Bio Inc.	TAKT9142Z	pH 7,6 100 compresse
Sistema di blocco della biotina	Dako	X0590	Avidin 0,1% e Biotina 0,01%
Siero d'asino normale	Jackson Immunoresearch	017-000-001	5% vol./vol. concentrazione
Fluoroshield con DAPI	Sigma-aldrich	Codice: F6057	Concentrazione di 1,5 μg/mL
Vetrino coprioggetti in vetro Knittel	Knittel Gläser,	100039	24x60 mm 100 vetrini coprioggetti
Coniglio anti-CD8 Clone P17-V	Novus	NBP1-79055	utilizzare a 4μg/mL
Clone NAT anti-PD-1 del mouse	abcam	ab52587	utilizzare a 2 μg/mL
Capra anti-Tim-3	Ricerca e Sviluppo	AF2365	utilizzare a 3 μg/mL
Coniglio anti-PD-L1 Clone SP142	Roche	7309457001	utilizzare a 1 μg/mL
Topo AF647 etichettato pan- Cheratina Clone C11	Segnalazione cellulare	4528	utilizzare a 0,5 μg/mL
Capra anti-umano gal9	Ricerca e Sviluppo	AF2045	utilizzare a 0,3 μg/mL
Cyan 5 asino coniugato anti-coniglio	Jackson Immunoresearch	711-175-152	utilizzare a 5 μg/mL
IgG biotinilate F(ab'2) d'asino anti-topo	Jackson Immunoresearch	715-066-150	utilizzare a 3 μg/mL
Alexa Fluor488 asino coniugato anti-capra IgG	abcam	ab150133	utilizzare a 5 μg/mL
Streptavidina marcata con Cy3	Amersham	PA43001	utilizzare a 3 μg/mL
Mouse a controllo negativo IgG1	Dako	X0931	utilizzare a 2 μg/mL
IgG dal siero di capra	Sigma-aldrich	I5256	utilizzare a 3 μg/mL
IgG dal siero di coniglio	Sigma-aldrich	I5006	utilizzare a 4μg/mL