Imaging a immunofluorescenza multiplexato per analizzare sottopopolazioni di cellule T resistenti all'immunoterapia

Abstract

Fonte: Granier, C., et al. Analisi e quantificazione dell'immunofluorescenza multiplexata delle cellule T intratumorali PD-1⁺ Tim-3⁺ CD8⁺. J. Vis. Exp. (2018).

Questo video dimostra una tecnica di imaging multispettrale a fluorescenza in situ per analizzare diverse sottopopolazioni di cellule T infiltranti nel tessuto tumorale. Una criosezione tissutale di carcinoma a cellule renali viene trattata con anticorpi per marcare le cellule T CD8+ che esprimono specifici recettori inibitori e mostrano un fenotipo resistente all'immunoterapia. La sezione marcata viene visualizzata utilizzando un microscopio multispettrale per identificare le distinte sottopopolazioni di cellule T CD8+.

Protocollo

Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto

1. Colorazione in immunofluorescenza in situ di linfociti infiltranti il tumore (TIL)

1. Linee guida procedurali
   1. Eseguire tutte le fasi sperimentali a temperatura ambiente.
   2. Per tutti i passaggi, eseguire le diluizioni con Tris Buffer Saline (TBS; vedere la tabella dei materiali).
   3. Eseguire il lavaggio in TBS per tutti i passaggi tranne dopo l'incubazione degli anticorpi primari. Per quest'ultimo, utilizzare Tris Buffer Saline Tween20 (TBST, vedere Tabella dei Materiali). Per la composizione e la ricostituzione del tampone, vedere la Tabella 1.
   4. Utilizzare una camera di umidità per l'incubazione degli anticorpi e un barattolo di colorazione per il lavaggio.
   5. Non lasciare che la sezione si asciughi durante la procedura.
2. pretrattamento
   1. Scongelare il vetrino contenente il campione di tessuto e asciugare accuratamente il vetrino attorno al campione con un tovagliolo di carta. Delimitare l'area di reazione contenente il tessuto con una penna barriera idrofobica (vedere la Tabella dei Materiali). Asciugare per 2 min.
   2. Fissare i campioni in acetone al 100% per 5 minuti, asciugare per 2 minuti e lavare con TBS per 10 minuti.
3. Saturazione e blocco
   1. Pretrattare i vetrini per 10 minuti con 3 gocce di avidina 0,1%, picchiettare e/o scorrere il vetrino per distribuire l'avidina e rimuovere le bolle d'aria, quindi trattare per 10 minuti con 3 gocce di biotina 0,01% (vedere Tabella dei materiali), picchiettare e/o sfiorare. Lavare con TBS.
   2. Eseguire un blocco dei recettori Fc. Applicare 100 μl di un 5% in volume/volume di siero normale diluito in TBS. Utilizzare siero della stessa specie ospite dell'anticorpo secondario o terziario marcato (vedere Tabella dei materiali); Qui veniva usato il siero d'asino. Incubare per 30 min.
   3. Durante l'incubazione, far girare brevemente gli anticorpi anti-CD8, la proteina 1 della morte cellulare del programma (PD-1) e le immunoglobuline delle cellule T e la proteina-3 contenente mucina (Tim-3) (Tabella dei materiali). Preparare la miscela di anticorpi primari nella TBS come descritto nella Tabella 2.
4. Immuno-colorazione per CD8, PD-1 e Tim-3
   1. Preparare la miscela di anticorpi primari. Fare riferimento alla Tabella dei materiali e alla Tabella 2 per gli anticorpi utilizzati (anti-CD8, PD-1, Tim-3 e i corrispondenti anticorpi secondari) e le loro concentrazioni.
   2. Tocca e/o scorri il siero d'asino rimanente (aggiunto al passaggio 1.3.2). Incubare i vetrini con 100 μl della miscela di anticorpi primari non marcati per 1 ora in una camera umidificata.
   3. Durante l'incubazione, centrifugare brevemente gli anticorpi anti-coniglio Cyanine 5, Alexa Fluor 488-anti-capra e anti-topo biotinilato e preparare il mix di anticorpi secondari come descritto nella Tabella 2.
   4. Lavare i vetrini in TBST per 5 minuti. Asciugare i vetrini.
   5. Incubare i vetrini con 100 μl di anticorpi secondari per 30 minuti in una camera umidificata.
   6. Preparare la miscela di anticorpi terziari contenenti cianina 3-streptavidina, come descritto nella Tabella 2.
   7. Lavare i vetrini in TBS per 10 minuti. Asciugare i vetrini.
   8. Incubare i vetrini con 100 μl della miscela di anticorpi terziari per 30 minuti.
   9. Lavare i vetrini in TBS per 10 minuti. Asciugare i vetrini.
5. Montaggio su cella
   1. Montare i vetrini in un terreno di montaggio contenente dicloridrato (DAPI) contenente 4',6-Diamidino-2-Fenilindolo (1,5 μg/mL DAPI) con un vetrino coprioggetti compatibile per la microscopia a fluorescenza (vedi Tabella dei materiali).
      nota: Come controllo negativo per ogni esperimento, è stato utilizzato un vetrino con anticorpi corrispondenti all'isotipo alla stessa concentrazione degli anticorpi corrispondenti. Per questa colorazione, abbiamo utilizzato anticorpi di controllo IgG1 di topo, IgG di coniglio e IgG-negativi di capra (vedi Tabella dei materiali). Come controllo positivo, abbiamo utilizzato la tonsilla iperplasica umana, che è nota per essere positiva per i marcatori testati, per ogni esperimento. Una colorazione tipica è descritta nei risultati (Figura 1). La monocolorazione di CD8, PD-1 e Tim-3 deve essere eseguita individualmente (una colorazione per vetrino) con lo stesso pretrattamento e senza DAPI. Deve essere eseguito anche un vetrino nelle stesse condizioni sperimentali senza alcun anticorpo e solo un mezzo di montaggio DAPI. Un vetrino deve essere visualizzato utilizzando condizioni sperimentali identiche senza alcun anticorpo e senza DAPI.

2. Analisi della fluorescenza e conteggio automatico delle cellule

1. Acquisizione delle immagini con il microscopio automatizzato
   1. Creare un protocollo.
      1. Accendere il software del microscopio automatizzato e l'illuminatore a fluorescenza.
      2. Nella barra dei menu, fai clic su "File", "Crea protocollo", seleziona "DAPI", "FITC" e "TRITC".
      3. Fai clic su "Avanti", "Sezione tessuto" e fai clic su "Avanti", "Nome protocollo". Scegli un nome, ad esempio "CD8-PD-1-Tim-3", fai clic su "Avanti" e "Salva".
      4. Posiziona manualmente una diapositiva sullo stage.
      5. Nella barra dei menu, fai clic su "configurazione" e "impostazioni". Fai clic su "Imposta casa Z" nella nuova finestra.
      6. Regolare il tempo di esposizione con un vetrino di controllo positivo, ad esempio un CD8, PD-1 e Tim-3 triplo colorato con un campione DAPI.
      7. Nella barra di controllo, fai clic su "imposta esposizione".
      8. Regolare il tempo di esposizione per ciascun filtro fino a ottenere un segnale sufficiente ma non saturante.
      9. Per l'imaging monocromatico, effettuare le seguenti operazioni:
      10. Seleziona l'acquisizione e, in "messa a fuoco automatica", scegli il filtro DAPI.
      11. Nel "limite dell'area di scansione", sposta l'obiettivo in alto nell'angolo in alto a sinistra della diapositiva. Fare clic su "Segna". Fai lo stesso per l'angolo in basso a destra.
          nota: Questo passaggio delimita l'area di imaging a bassa potenza (imaging LP) a 4X; Assicurati di posizionare bene il segno per circondare tutti i campioni della serie.
      12. Per l'imaging ad alta potenza (HP), eseguire le seguenti operazioni:
      13. Nella sezione "Messa a fuoco automatica", scegli "DAPI".
      14. Nella banda "Acquisizione", scegli "DAPI", "FITC", "Cy3" e "Cy5". Fare clic su "OK". Fai clic su "File" e "Salva protocollo" nella barra dei menu.
   2. Scansiona le diapositive.
      1. Caricare il protocollo facendo clic su "File" e "Carica protocollo" dalla barra dei menu. Fare clic su "Avvia".
      2. Immettere "Lab ID" (posizione della cartella per l'archiviazione delle immagini). Immettere l'ID diapositiva per identificare la diapositiva. Fare clic su "Avanti".
      3. Fare clic su "Imaging monocromatico" (per scansionare l'intero vetrino in condizioni di luce in campo chiaro e acquisire immagini sequenziali utilizzando un obiettivo 4x).
         nota: In questo modo si ottiene una panoramica in scala di grigi della diapositiva.
      4. Fare clic su "Trova campione". Selezionare l'area di tessuto da scansionare a bassa risoluzione (4x): tenere premuto il tasto 'Ctrl' e fare clic su un campo utilizzando il cursore per selezionare o deselezionare i campi (Figura 2A).
      5. Fare clic su "LP Imaging" (imaging 4x) per l'acquisizione di immagini fluorescenti Rosso Blu Verde di ciascun campo.
      6. Per la selezione del campo HP, tenere premuto il tasto 'Ctrl' e fare clic su un campo utilizzando il cursore per selezionare o deselezionare i campi corrispondenti all'area di tessuto che verrà scansionata ad alta risoluzione (20x). Selezionare 5 campi (Figura 2B).
      7. Fare clic su "HP Imaging" (imaging 20x) per un'acquisizione di immagini multispettrali di ciascun campo (Figura 2C).
      8. Fai clic su "Archiviazione dati" per memorizzare le immagini nella cartella selezionata all'inizio in LabID.
         nota: Il processo è riassunto e illustrato nella Figura 2. Per ogni fase (rilevamento dei tessuti, selezione del campo), un algoritmo può essere incrementato e addestrato dall'utente per un processo di scansione completamente automatizzato.

Tabella 1: Composizione del buffer di TBS e TBST. Il TBS viene utilizzato per miscele e diluizioni di anticorpi. Per i lavaggi, tutte le fasi vengono eseguite con TBS ad eccezione dei lavaggi successivi agli anticorpi primari, per i quali si raccomanda TBST.

	Tbs	TBST
Tris-HCl	0,05 m sopra il livello del mare	0,05 m sopra il livello del mare
NaCl	0,15 m sopra il livello del mare	0,15 m sopra il livello del mare
Interpolazione 20	-	0,05%
ph	7.6	7.6
preparazione	1 compressa in 500 mL H2O

Tabella 2: Composizione dettagliata della miscela di anticorpi per la colorazione in immunofluorescenza CD8-PD-1-Tim-3. Per ogni miscela di anticorpi primari, secondari e terziari, la diluizione da eseguire nel volume corrispondente di TBS è data per un volume totale di 1 mL. Per un vetrino, il volume totale di reazione è di 100 μl per un'area tissutale di 2 cm².

Il volume dell'anticorpo primario			V finale = 1 ml
Coniglio anti-CD8	Mouse anti-PD-1	Capra anti-Tim-3	Tbs
1,6 μl	2 μl	30 μl	966,4 μl
Il volume dell'anticorpo secondario
Ciano 5 anti-coniglio	Biotinilato anti-topo	Alexa Fluor 488 anti-capra	Tbs
3,3 μl	2 μl	2,5 μl	992,2
Il volume dell'anticorpo terziario
	Streptavidina marcata con Cy3		Tbs
	3,3 μl		996,7

Risultati

Figura 1: Immunocolorazione CD8-PD-1-Tim-3 su un tessuto incluso in paraffina tonsillare. Per la tripla immunocolorazione sono state selezionate sezioni di tessuto incluse in paraffina invece di sezioni crioconservate. Dopo la deceratura e la reidratazione, è stato applicato lo stesso protocollo di colorazione precedentemente sviluppato per le sezioni crioconservate. Le cellule T CD8+ si trovano all'...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Vectra 3 Imaging patologico quantitativo automatizzato	Perkin Elmer	CLS142338
Analisi cellulare inForm 2.1.	Perkin Elmer	CLS135781
R software	https://www.r-project.org
Penna di delimitazione Dakopen	Dako	Episodio 2002
Tris Buffer Soluzione Salina TBS Compresse	Takara, Bio Inc.	TAKT9141Z	pH7.6 100 compresse
Tris Buffer soluzione salina Tween 20 TBS (+Tween20)	Takara, Bio Inc.	TAKT9142Z	pH 7,6 100 compresse
Sistema di blocco della biotina	Dako	X0590	Avidin 0,1% e Biotina 0,01%
Siero d'asino normale	Jackson Immunoresearch	017-000-001	5% vol./vol. concentrazione
Fluoroshield con DAPI	Sigma-aldrich	Codice: F6057	Concentrazione di 1,5 μg/mL
Vetrino coprioggetti in vetro Knittel	Knittel Gläser,	100039	24x60 mm 100 vetrini coprioggetti
Coniglio anti-CD8 Clone P17-V	Novus	NBP1-79055	utilizzare a 4μg/mL
Clone NAT anti-PD-1 del mouse	abcam	ab52587	utilizzare a 2 μg/mL
Capra anti-Tim-3	Ricerca e Sviluppo	AF2365	utilizzare a 3 μg/mL
Coniglio anti-PD-L1 Clone SP142	Roche	7309457001	utilizzare a 1 μg/mL
Topo AF647 etichettato pan- Cheratina Clone C11	Segnalazione cellulare	4528	utilizzare a 0,5 μg/mL
Capra anti-umano gal9	Ricerca e Sviluppo	AF2045	utilizzare a 0,3 μg/mL
Cyan 5 asino coniugato anti-coniglio	Jackson Immunoresearch	711-175-152	utilizzare a 5 μg/mL
IgG biotinilate F(ab'2) d'asino anti-topo	Jackson Immunoresearch	715-066-150	utilizzare a 3 μg/mL
Alexa Fluor488 asino coniugato anti-capra IgG	abcam	ab150133	utilizzare a 5 μg/mL
Streptavidina marcata con Cy3	Amersham	PA43001	utilizzare a 3 μg/mL
Mouse a controllo negativo IgG1	Dako	X0931	utilizzare a 2 μg/mL
IgG dal siero di capra	Sigma-aldrich	I5256	utilizzare a 3 μg/mL
IgG dal siero di coniglio	Sigma-aldrich	I5006	utilizzare a 4μg/mL