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1. Semina cellulare e infezione virale
- A 20-24 ore prima dell'infezione virale, seminare 5 x 104 cellule di fibroblasti del polmone embrionale umano (HEL) o altre cellule da esaminare su un vetrino sfalsato a 4 pozzetti da 11 mm in terreno di crescita (Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS)). Incubare le cellule a 37 °C con il 5% di anidride carbonica (CO2).
nota: Ogni pozzetto dovrebbe avere il 70-80% di confluenza cellulare al momento dell'infezione.
- Il giorno successivo, rimuovere il terreno di coltura e infettare le cellule con i virus del Medium-199 a un intervallo di 4-10 pfu/cellula. Incubare le cellule infette da virus per 1 ora a 37 °C. Continuare a scuotere il vetrino durante il periodo di incubazione.
- Dopo 1 ora di incubazione, rimuovere il Medium-199 e integrare con il terreno di crescita.
nota: I farmaci che interferiscono con le diverse fasi dell'infezione possono essere aggiunti in questa fase o prima dell'assorbimento virale.
- Incubare le cellule infettate dal virus a 37 °C con il 5% di CO2 per varie durate del periodo di infezione.
2. Fissazione e permeabilizzazione
- Al momento dell'infezione, lavare rapidamente le cellule infette con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 3 volte e aggiungere 200 μL di paraformaldeide al 4% preparata al momento in PBS. Incubare le cellule con paraformaldeide per 8-10 minuti a temperatura ambiente per fissare le cellule in ogni pozzetto.
- Aspirare la paraformaldeide e lavare i pozzetti con 200 μL di PBS per 3 volte. Aspirare completamente il PBS dopo il 3° lavaggio.
- Aggiungere 100 μl di tensioattivo non ionico allo 0,2% in ciascun pozzetto per permeabilizzare le cellule per 5-10 minuti.
- Aspirare il tensioattivo non ionico e lavare i pozzetti con 200 μL di PBS per 3 volte.
3. Colorazione immunofluorescente
- Aspirare completamente il PBS e aggiungere 200 μL di tampone bloccante (1% di albumina sierica bovina (BSA) e 5% di siero di cavallo in PBS) in ciascun pozzetto e incubare a temperatura ambiente per 1 ora o a 4 °C per una notte.
- Aggiungere la concentrazione determinata sperimentalmente dell'anticorpo primario contro la proteina 0 della cellula infetta (anticorpo policlonale anti-ICP0 di coniglio) nel tampone bloccante e incubare l'anticorpo primario a temperatura ambiente per 2 ore o a 4 °C durante la notte.
- Lavare con tampone bloccante 3 volte con 10 minuti di incubazione. Aggiungere l'anticorpo secondario anti-coniglio di capra coniugato Alexa 594 (diluito 1:400 in tampone bloccante) e incubare i vetrini a temperatura ambiente per 1 ora. Quindi lavare i vetrini 3 volte con tampone bloccante a intervalli di 10 minuti.
- Infine, lavare il vetrino una volta con PBS per rimuovere i residui di BSA e siero di cavallo.
- Aggiungere una goccia di terreno di montaggio antisbiadimento con 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per montare il vetrino e sigillarlo con vetrino coprioggetti utilizzando smalto trasparente.
4. Imaging confocale
- Con un microscopio confocale, imposta la lunghezza d'onda a 590-650 nm per Alexa 594 e 410-520 nm per DAPI. Selezionare il formato dell'immagine a 1024 x 1024 e la media delle linee di 8 per acquisire immagini ad alta risoluzione.
- Analizzare ogni pozzetto sul vetrino a 4 pozzetti al microscopio confocale. Acquisire immagini cellulari rappresentative con l'obiettivo 100X, come mostrato nella Figura 1 e nella Figura 2.
- Per contare un gran numero di celle, scattare immagini di campi consecutivi sotto l'obiettivo 40X.
nota: Richiede 5-10 immagini per accumulare oltre 200 cellule infette da ogni punto temporale di ogni infezione.
- In ogni esperimento, scattare foto con parametri confocali costanti per tutti i campioni che devono essere confrontati.
5. Analisi della distribuzione nucleare e citoplasmatica
- Progetto aperto con il software applicativo confocale. Selezionare un'immagine da cui le cellule devono essere tabulate per la distribuzione nucleare rispetto a quella citoplasmatica di ICP0.
- Fai clic sulla scheda "Quantità" dal menu in alto e seleziona "ordina ROI" dal menu degli strumenti.
- Disegna una linea longitudinale attraverso la cella da analizzare selezionando "Disegna linea" dal menu in alto.
nota: Apparirà l'istogramma che mostra l'intensità della fluorescenza lungo la linea sia per ICP0 che per DAPI. Nell'istogramma, la linea blu rappresenta i pixel DAPI e segna il confine del nucleo, mentre la linea rossa rappresenta i pixel ICP0.
- Sulla base della colorazione di fondo, impostare una soglia costante per l'intensità di ICP0 per analizzare la distribuzione subcellulare di ICP0 in ogni esperimento.
- Come esemplificato nella Figura 2, se il segnale rosso in media è al di sotto della soglia nella regione nucleare ma è al di sopra della soglia oltre il confine blu, classificare il segnale rosso come prevalentemente localizzato nel citoplasma.
- Se il segnale rosso è al di sopra della soglia in tutto il nucleo e oltre il limite del segnale blu, raggruppare il segnale rosso come nucleo più localizzazione citoplasmatica.
- Se il segnale rosso è al di sopra della soglia nel nucleo ma in media è al di sotto di essa al di fuori del confine del segnale blu, raggruppare il segnale rosso come localizzazione nucleare.
- Tabulare più di 200 cellule infette da ciascun campione in diversi momenti di infezione e tracciare un grafico a barre per illustrare il movimento di ICP0 in base al tempo (Figura 3).
