Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Escissione chirurgica e preparazione dei tessuti
- Eutanasia del topo iniettando per via intraperitoneale 1 ml di tribromoetanolo (preparato secondo il protocollo standard; Tabella dei materiali).
nota: L'asfissia da CO2 deve essere evitata negli studi polmonari in quanto potrebbe causare lesioni polmonari e alterare le caratteristiche e le proprietà delle cellule immunitarie polmonari. Anche la lussazione cervicale dovrebbe essere evitata in quanto potrebbe causare lesioni meccaniche del polmone.
- Trasferire il mouse in un'area pulita e dedicata per l'operazione chirurgica.
- Stabilizzare il topo con il lato dorsale rivolto verso il basso utilizzando aghi o nastro adesivo sulle quattro estremità. Utilizzare etanolo al 70% per igienizzare la pelle della zona ventrale.
- Eseguire un'incisione nella pelle, dal collo all'addome. Rimuovere con cautela la pelle dalla zona toracica.
- Rimuovere con cura lo sterno e le costole.
- Lavare i polmoni iniettando 10 ml di soluzione salina fredda tamponata con fosfato (PBS) direttamente nel ventricolo destro, utilizzando un ago da 18-21 G, fino a quando i polmoni diventano completamente bianchi.
- Rimuovere con cautela il timo e il cuore senza toccare i polmoni.
- Staccare delicatamente i polmoni dai tessuti circostanti e trasferirli in una provetta con tampone freddo di albumina sierica bovina (BSA) (Tabella 1).
nota: È necessario fare uno sforzo per rimuovere tutto il grasso adiacente dai polmoni prima di preparare ulteriormente la sospensione a cellula singola, poiché ciò potrebbe influenzare le letture.
2. Preparazione della sospensione a cella singola
- Trasferire i polmoni in una capsula di Petri vuota e tritarli con due bisturi fini. Trasferire tutti i pezzi del polmone tritato in una nuova provetta conica da 50 mL. Utilizzare 5 ml di tampone digestivo per lavare la piastra e aggiungerlo alla provetta da 50 ml contenente il polmone tritato (Tabella 1).
nota: Il tampone per la digestione deve essere preparato immediatamente prima dell'uso. Utilizzare 5 mg/mL di collagenasi. La combinazione di 1 o 5 mg di collagenasi con tampone BSA o PBS privo di proteine non ha migliorato i risultati (Figura 1).
- Fissare il coperchio della provetta e digerire il polmone per 30 minuti su un agitatore orbitale a una velocità di 150 giri/min a 37 °C. Arrestare la reazione aggiungendo 10 mL di tampone BSA freddo.
- Dopo la digestione, utilizzare un ago da 18 G per mescolare e sciogliere i pezzi polmonari. Posizionare un filtro da 70 μm nella parte superiore di una nuova provetta conica da 50 mL.
nota: L'uso di un filtro micron più piccolo potrebbe comportare la perdita delle principali popolazioni mieloidi.
- Trasferire lentamente la miscela polmonare digerita direttamente sul colino. Utilizzare il lato in gomma di uno stantuffo per siringa da 10 ml per frantumare i pezzi di polmone rimanenti sul filtro. Lavare il materiale lavorato sul filtro con tampone BSA.
- Centrifugare la sospensione monocellulare a 350 × g per 8 minuti a 4 °C.
- Scartare con cautela il surnatante e risospendere le cellule in 1 mL di tampone di lisi ammonio-cloruro-potassio (ACK). Mescolare bene con una pipetta da 1 ml e incubare per 90 s a temperatura ambiente.
- Aggiungere 10 mL di tampone BSA freddo per arrestare la reazione e centrifugare a 350 × g per 7 minuti a 4 °C.Scartare con cautela il surnatante e risospendere il pellet nel tampone di colorazione per contare le cellule utilizzando un emocitometro.
- Risospendere le cellule a una concentrazione di 5 × 106 cellule/mL e utilizzarle per la colorazione superficiale (vedere paragrafo 2).
nota: A tale scopo, le cellule vengono piastrate in una piastra a fondo tondo a 96 pozzetti, seguita dalla colorazione degli anticorpi e dai lavaggi. Se non è disponibile una centrifuga a piastre, utilizzare tubi di flusso invece di piastre. Con questo protocollo, ~15-20 × 106 cellule per polmone possono essere ottenute da un topo C57BL/6 di 6-10 settimane di dimensioni medie.
3. Colorazione degli anticorpi superficiali
- Trasferire 1 × 106 celle in 200 μl per pozzetto in una piastra da 96 pozzetti. Centrifugare la piastra a 350 × g per 7 minuti a 4 °C. Nel frattempo, preparare la soluzione di blocco Fc diluendo l'anticorpo anti-16/32 (1:100) nel tampone di colorazione (Tabella 1).
- Risospendere le cellule in 50 μl della soluzione bloccante Fc pre-preparata (Tabella dei materiali) e incubare per 15-20 minuti a 4 °C o su ghiaccio.
- Aggiungere 150 μl di tampone di colorazione e centrifugare la piastra a 350 × g per 5 minuti a 4 °C. Nel frattempo, preparare il cocktail di anticorpi di superficie diluendo gli anticorpi di superficie (1:100; Tabella 2) nel tampone di colorazione.
NOTA: (i) L'anticorpo anti-16/32 per il blocco dell'FC può essere utilizzato con gli anticorpi di superficie nella stessa miscela. ii) Se si utilizza un colorante di vitalità fissabile, aggiungerlo al cocktail di anticorpi di superficie a una diluizione di 1:1.000.
- Risospendere le cellule in 50 μl del cocktail di anticorpi di superficie pre-preparato e incubare per 30-40 minuti a 4 °C al buio. Lavare le celle con tampone colorante due volte.
nota: Se non è richiesta alcuna colorazione intracellulare, risospendere le cellule in 200 μL di tampone di colorazione e procedere direttamente all'acquisizione dei dati sul citometro a flusso. In alternativa, le cellule possono essere fissate e conservate a 4 °C per l'acquisizione successiva. Si consiglia di utilizzare le cellule per la citometria a flusso entro 24 ore.
4. Fissazione cellulare e colorazione intracellulare
- Preparare il tampone di fissazione/permeabilizzazione (Fix/Perm Buffer) mescolando tre parti di concentrato di fissazione/permeabilizzazione e 1 parte di diluente di fissazione/permeabilizzazione del set di tamponi di colorazione FoxP3/Transcription Factor (Tabella 1).
- Risospendere le cellule in 50 μl del tampone Fix/Perm pre-preparato per pozzetto della piastra a 96 pozzetti, dove le cellule sono state piastrate come descritto nella sezione 3, e incubarle per 20-25 minuti a 4 °C al buio.
- Diluire il tampone di permeabilizzazione 10x come 1:10 in acqua deionizzata purificata per preparare il tampone di permeabilizzazione 1x.
- Lavare le cellule una volta con 1x tampone di permeabilizzazione. Nel frattempo, preparare il cocktail di anticorpi intracellulari diluendo gli anticorpi intracellulari (1:100) in 1 mL di tampone di permeabilizzazione.
- Risospendere le cellule utilizzando 50 μl del cocktail di anticorpi di superficie pre-preparato per ogni cellula della piastra a 96 pozzetti e incubare per 40 minuti a 4 °C al buio.
- Lavare le cellule una volta con il tampone di permeabilizzazione e una volta con il tampone di colorazione. Dopo il lavaggio finale, risospendere le cellule in 200 μL di tampone di colorazione.
nota: Se non è disponibile un citometro a flusso con lettore di piastre, trasferire le cellule in provette per citometria a flusso.
- Acquisire un minimo di 1,5 × 106 cellule per campione sul citometro a flusso.
nota: Per i singoli colori e i campioni di controllo non colorati, saranno sufficienti 0,5-1 × 106 cellule per campione. Si raccomanda di titolare i singoli anticorpi utilizzati per ottenere una colorazione ottimale e ridurre i costi. Il presente protocollo è stato ottimizzato utilizzando il tampone Fix/Perm preparato utilizzando il set di tamponi di colorazione FoxP3. Poiché il CD68 è un marcatore citoplasmatico e non nucleare, potrebbero essere sufficienti altre soluzioni di permeabilizzazione come una bassa concentrazione di paraformaldeide o kit citofisso/citopermanente di vari fornitori.
Tabella 1: Buffer.
| Tampone BSA | PBS + 0,5% albumina sierica bovina |
| Tampone per la digestione | Tampone BSA preriscaldato (37 °C) + 5 mg/mL di collagenasi di tipo 1 + 0,2 mg/mL di DNasi I |
| Tampone di colorazione | PBS + 2,5% FBS |
| Buffer fisso/permanente | Tre parti di diluente per fissazione/permeabilizzazione e 1 parte di diluente per fissazione/permeabilizzazione del set di tamponi per colorazione Foxp3/Transcription Factor |
| Tampone di permeabilizzazione | 10x tampone di permeabilizzazione dal set di tamponi di colorazione Foxp3/Transcription Factor diluito 10 volte in acqua deionizzata purificata |
Tabella 2: Utilizzo di anticorpi monoclonali.
| antigene | clone | fluorocromo | diluizione | Superficie/intracellulare |
| CD45 | 30-F11 | APC/CY7 | s1:100 | Superficie |
| Gr-1 | RB6-8C5 | BV421 | s1:100 | Superficie |
| CD68 | FA-11 | PerCPCy5.5 | s1:100 | intracellulare |
| CD11b | M1/70 | PECy7 | s1:100 | Superficie |
| Siglec F | S17007L | FITC | s1:100 | Superficie |
| CD11c | N418 | BV650 o BV510 | s1:100 | Superficie |
| CD64 | X54-5/7.1 | PE/Dazzle 594 | s1:100 | Superficie |
| MHC-II | M5/114.15.2 | AF700 | s1:100 | Superficie |
| CD103 | 2.00E+07 | PE / FITC | s1:100 | Superficie |
| Kit di macchie di cellule morte a lettura lontana riparabile Live/Dead | | FarRed (APC) o Aqua (BV510) | s1:1000 | Superficie |
| CD3 | 17A2 | Pe | s1:100 | Superficie |
| B220 | RA3-6B2 | AF488 | s1:100 | Superficie |
| NK1.1 | PK136 | FITC | s1:100 | Superficie |
| CD24 | 30-F1 | Pe | s1:100 | Superficie |
| MERTK | 2B10C42 | Pe | s1:100 | Superficie |
| F4/80 | BM8 | BV605 | s1:100 | Superficie |
| CX3CR1 | SA011F11 | Pe | s1:100 | Superficie |
| Blocco Fc (CD16/32) | 93 | | s1:100 | Superficie |
