Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione della proteina dell'antigene MRSA HI
- Ottenere cloni del fattore B che determina la superficie degli ioni Fe (IsdB) e del mutante della α-emolisina (Hla) da fonti commerciali (vedi Tabella dei materiali), eseguire l'amplificazione della reazione a catena della polimerasi (PCR) per amplificare i geni IsdB e Hla e legare i loro prodotti al plasmide PGEX-6P-2 (ottenuto commercialmente; vedi Tabella dei materiali). Schermo con il ceppo vettore Xl/blu di Escherichia coli.
- Trasformare il clone positivo in cellule competenti per E. coli BL21 (vedi Tabella dei materiali) e amplificare con coltura di squalo.
- Esprimere l'antigene e isolarlo dopo induzione con i kit di isolato isopropil-β-D-1-mercaptogalattopiranoside e cromatografia multimodale (MMC) (vedere Tabella dei materiali).
- Caratterizzare la proteina dell'antigene e purificarla con un purificatore completamente automatizzato.
- Purificare per affinità le proteine marcate con gutatione S-transferasi (GST) da lisati chiarificati utilizzando una resina per cromatografia di affinità disponibile in commercio (vedere la Tabella dei materiali).
- Purificare le proteine ricombinanti mediante isopropil-β-D-1-mercaptogalattopiranoside e cromatografia multimodale (MMC).
- Rimuovere l'endotossina con il metodo di separazione di fase Triton X-114. In breve, mescolare Triton X-114 all'1% con eluato proteico ricombinante a 0 °C per 5 minuti per garantire una soluzione omogenea e incubare a 37 °C per 5 minuti per consentire la formazione di due fasi.
- Utilizzare il metodo di test dell'endotossina batterica con i kit Turtle (vedere la tabella dei materiali) per rilevare la concentrazione di endotossine. L'endotossina per l'antigene proteico è 0,06 EU/μg, inferiore allo standard internazionale (1,5 EU/μg).
- Eseguire un test di interferenza per eliminare la possibile influenza del prodotto in esame sul rilevamento delle endotossine.
nota: Secondo l'Appendice 2020 della farmacopea cinese, il contenuto di endotossine dovrebbe essere inferiore a 5 EU/dose. La sensibilità del lisato di Limulus (λ0,25 EU/mL) e il rapporto di diluizione efficace massimo di 33,3 sono stati calcolati sulla base della diluizione massima valida, MVD = cL/λ, dove L è il valore limite dell'endotossina batterica per l'articolo in esame, c è la concentrazione della soluzione dell'articolo in esame e quando L è espresso in EU/m, c è pari a 1,0 mg/mL. λ è la sensibilità marcata (EU/mL) del reagente del granchio a ferro di cavallo nel metodo gel.
- Ricombinare l'antigene (48 kDa, determinato mediante elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide al 12% [SDS-PAGE]) a 1,5 mg/mL in acqua sterile senza endotossina o soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (metodo del diclorato di sodio).
NOTA: Il tempo di picco della proteina è stato di 13,843 minuti, la purezza è stata del 99,4% (metodo di cromatografia liquida ad alte prestazioni) e la proteina è stata conservata a -70 °C. Il DNA genomico estratto dal ceppo di S. aureus MRSA252 (vedi Tabella dei materiali) è stato utilizzato come modello di PCR. Il gene IsdB è stato amplificato utilizzando il primer diretto 59-CGCGGATCCATGAATGGCGAAGCAAAAGCAG
C-39 e l'innesco inverso 59-TTTTCCTTTTTTGCGG
CCGCCTATGTCATATCTTTATTAGATTCTTC-39.
Il gene Hla è stato amplificato utilizzando il primer diretto PHLAF (GCGGATCCGATTCTGATATTAATATTAAAACC) e il primer inverso PHLAR (TAAGCGGCCGCTTATCAATTTGTCATTTCTTC).
2. Preparazione del vaccino in nanoemulsione
- In base al rapporto di massa di 1:6:3 (p/p), aggiungere tre tipi di eccipienti in sequenza (isopropil miristato, olio di ricino poliossietilene e glicole propilenico; vedere Tabella dei materiali) alla soluzione proteica dell'antigene HI (10 mg/mL) e mescolare bene. Quindi, aggiungere acqua pura gradualmente sterilizzata fino a raggiungere un volume finale di 10 mL e mescolare a 500 giri/min e 25 °C per circa 20 minuti.
nota: La nanoemulsione preparata in questo protocollo ha un volume di 10 mL e le masse dei tre eccipienti sono rispettivamente di 0,34 g, 2 g e 1 g. La soluzione proteica qui è la soluzione di lavoro, 10 volte la concentrazione della soluzione finale.
- Preparare il vaccino adiuvante a nanoemulsione (proteina da 1 mg/mL) con metodi di emulsione a bassa energia per ottenere una soluzione liquida chiara e trasparente.
nota: La nanoemulsione bianca (BNE) è stata preparata con metodi simili, tranne per il fatto che l'acqua è stata sostituita con HI. Il metodo di emulsione abituale prevede il riscaldamento delle fasi esterna e interna a circa 80 °C per l'emulsione e quindi l'agitazione e il raffreddamento graduale. In questo processo si consuma una grande quantità di energia e, infine, si ottiene l'emulsione.
3. Caratterizzazione fisica e stabilità del vaccino adiuvante a nanoemulsione
- Dimensione delle particelle, potenziale zeta e caratterizzazione dell'indice di dispersione polimerica (PDI).
- Preparare 100 μl di vaccino adiuvante a nanoemulsione e diluire 50 volte con acqua per preparazioni iniettabili. Aggiungere 2 mL di campione per il rilevamento.
- Osservare le dimensioni delle particelle, il potenziale zeta e la PDI a 25 °C utilizzando un Nano Zetasizer (ZS; vedere la Tabella dei materiali).
- Microscopia elettronica a trasmissione (TEM)
- Diluire 10 μL di vaccino in nanoemulsione 50 volte con acqua, posizionare su una griglia di rame da 100 maglie rivestita di carbonio e colorare con acido fosfotungstico all'1% (vedi Tabella dei materiali) per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Rimuovere la soluzione di acido fosfotungstico in eccesso con carta da filtro.
- Osservare la morfologia al microscopio elettronico a trasmissione (vedi Tabella dei materiali). Esaminare se i prodotti finiti sono quasi stabili e circolari all'interno del campo visivo del microscopio elettronico e se mostrano una buona dispersione.
- Microscopia elettronica a scansione (SEM)
- Diluire 10 μl di vaccino adiuvante a nanoemulsione 50 volte con acqua, far cadere 10 μl di campioni prediluiti su un wafer di silicio e metterli in un incubatore controllato da termostato a 37 °C per 24 ore.
- Spruzzare il platino preparato sul silicone per 40 s e raffreddare a temperatura ambiente.
- Osservare le proprietà morfologiche dei campioni preparati al microscopio elettronico a scansione ad alta risoluzione (vedi Tabella dei materiali). Determinare se i campioni sono quasi stabili, sferici e ben dispersi all'interno del campo visivo al microscopio elettronico.
- Stabilità morfologica
- Posizionare 1 mL di campioni di vaccino in nanoemulsione in provette da microcentrifuga e valutare la stabilità dei campioni freschi centrifugando per 30 minuti a 13.000 x g a temperatura ambiente (25 ° C).
- Osservare l'aspetto di questi campioni freschi ed eseguire quindi una prova di stabilità termodinamica di sei cicli di temperatura (un ciclo: conservare a 4 °C per 48 ore, 25 °C per 48 ore e 37 °C per 48 ore).
- Dopo la centrifugazione, lasciare riposare i campioni per 15 minuti per determinare se c'è un effetto Tyndall (se il campione è limpido e trasparente alla luce) e se si è verificata una demulsificazione (mostrata da una chiara stratificazione dopo la demulsificazione).
- SDS-PAGE e western blot
- Agitare i campioni, mescolare una soluzione di 0,6 mL di etanolo assoluto e 0,3 mL di vaccino, quindi centrifugare (13.000 x g, 30 min a temperatura ambiente, 25 °C).
- Trasferire il surnatante della soluzione in una provetta pulita e sciogliere il precipitato con 0,3 mL di acqua. Ottenere le soluzioni di surnatante e precipitato (sia nanoemulsione in bianco che vaccino) dopo il trattamento con etanolo assoluto e soluzione di acqua distillata ed eseguire la stessa diluizione di 50 volte.
- Miscelare 2,5 mL di gel di separazione A e 2,5 mL di gel di separazione B (vedere la Tabella dei materiali), aggiungere 50 μl di persolfato di ammonio al 10% e posizionare rapidamente la soluzione nella lastra di vetro con una pipetta. Mescolare 1 mL di gel concentrato A e 1 mL di gel concentrato B, aggiungere 20 μL di persolfato di ammonio al 10% nella lastra di vetro, inserire un pettine di dimensioni adeguate e attendere la solidificazione.
- Aggiungere un totale di 5 μl di soluzione tampone per la carica proteica 5x al campione diluito ottenuto nella fase 3.5.2 e far bollire il campione per 5 minuti.
- Aggiungere 10 μL di proteina riscaldata al pozzetto corrispondente e aggiungere 5 μL di marcatore proteico al pozzetto del marcatore.
- Collegare l'elettrodo, accendere l'elettroforesi (vedere la tabella dei materiali) e regolare la tensione a 300 V. Spegnere l'alimentazione quando l'elettroforesi raggiunge 1 cm di distanza dal fondo della gomma PAGE.
- Rimuovere il gel e risciacquare con acqua bidistillata (ddH2O). Aggiungere la soluzione colorante G-250 blu brillante di Coomassie (vedere la tabella dei materiali) per 10 minuti. Versare la soluzione colorante e sciacquare il gel due volte con la soluzione e la soluzione decolorante disponibile in commercio e cuocere il gel nel microonde per 1 minuto. Agitare il gel per 10 minuti e cambiare ripetutamente la soluzione decolorante fino a quando lo sfondo del gel non è chiaro. Quindi, eseguire l'imaging su gel (vedi Tabella dei materiali).
nota: Il western blot è stato pre-processato, come descritto nei passaggi 3.5.1-3.5.6.
- Immergere tre blocchi di carta da filtro con un tampone di trasferimento per elettroforesi. Immergere la membrana in fluoruro di polivinilidene (PVDF) in metanolo per 30 s e trasferirla con uno strumento di trasferimento in gel semisecco (due strati di carta da filtro, membrana in PVDF, gel per elettroforesi e uno strato di carta da filtro). Utilizzare una tensione di 23 V per trasferire la membrana per 23 minuti.
- Rimuovere la membrana in PVDF e lavare una volta con soluzione salina tamponata tris-Tween 20 (TBST) dopo il trasferimento.
- Immergere la membrana in PVDF in una soluzione sigillante (soluzione di latte scremato in polvere al 5%) e sigillare per una notte a 4 °C.
- Rimuovere la membrana in PVDF e lavare tre volte con TBST o 10 min ciascuna.
- Incubare con l'anticorpo primario (da topi immunizzati con siero positivo). Diluire l'anticorpo primario (vedere la Tabella dei materiali) da testare 500 volte (100 volte) con TBST. Posizionare la membrana in PVDF bloccata nell'anticorpo primario e incubare a 37 °C per 1 ora.
- Rimuovere la membrana in PVDF e lavare tre volte con TBST per 10 minuti ciascuna.
- Incubare con l'anticorpo secondario (vedere Tabella dei materiali). Diluire l'anticorpo secondario di capra marcato con fosfatasi alcalina (AP) 5.000 volte con TBST. Posizionare la membrana in PVDF nell'anticorpo secondario e incubare a 37 °C per 40 minuti.
- Rimuovere la membrana in PVDF e lavare quattro volte con TBST per 10 minuti ciascuna.
- Immergere le membrane PVDF in una miscela (quanto basta per immergere la membrana) del substrato AP nitro blu tetrazolo (NBT) e BCIP (sale di 5-bromo-4-cloro-3'-indolifosfato p-toluidina) (vedi Tabella dei materiali) per la colorazione. Un risultato positivo è purple.
NOTA: I risultati devono essere una banda viola chiara e la striscia del campione e il peso molecolare dell'antigene devono essere nella stessa posizione etichettata.
4. Valutazione della risposta immunitaria anticorpale a questo vaccino dopo somministrazione intramuscolare
NOTA: I topi sono stati immunizzati mediante iniezione intramuscolare del vaccino a base di nanoemulsione a seguito di un rapporto pubblicato. Ai topi è stato somministrato PBS come controllo negativo. A 1 settimana dopo il completamento di tre vaccinazioni, il siero è stato raccolto dai topi. I livelli sierici di IgG e le sottoclassi di IgG1, IgG2a e IgG2b sono stati determinati quantitativamente mediante saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA).
- Rivestimento dell'antigene: diluire l'antigene proteico HI a 10 μg/mL con una soluzione di rivestimento e aggiungerlo alla piastra ELISA a 100 μL/pozzetto. Incubare a 4 °C per una notte.
nota: La soluzione di rivestimento viene preparata sciogliendo 1,6 g di carbonato di sodio anidro e 2,9 g di bicarbonato di sodio in 1 L di acqua deionizzata.
- Sigillatura: Lavare la piastra (tre cicli, ogni ciclo 300 μL). Aggiungere 300 μl della soluzione sigillante a ciascun pozzetto e sigillare i pozzetti per 2 ore a 37 °C.
nota: La soluzione sigillante viene preparata aggiungendo Tween-20 e albumina sierica bovina (BSA) al PBS. Il contenuto di BSA nella soluzione PBST è dell'1%.
- Diluizione del siero: diluire il siero campione di topi 100 volte con PBST (prelevare 3 μL di siero e aggiungerlo a 297 μL di PBST e vortex) e utilizzare 100 μL per ogni campione di siero. Diluire il siero positivo e il siero di controllo negativo 100 volte con PBST aggiungendo 4 μL a 396 μL di PBST, quindi miscelare mediante vortex.
- Diluizione a doppio rapporto: aggiungere 200 μl del siero sperimentale diluito di cui sopra alla prima fila della piastra ELISA rivestita e aggiungere 100 μl di PBST a tutti i pozzetti tranne la prima e ladodicesima fila. Eseguire una diluizione 1:2 in successione dalla prima fila: regolare la pipetta a 100 μl, trasferire 100 μl dalla prima alla seconda fila e mescolare con la pipetta 10 volte.
- Diluire il siero alla riga 11 in rapporti multipli ed eliminare 100 μL di liquido.
- Aggiungere il siero diluito negativo e positivo ai pozzetti corrispondenti nella riga 12 secondo il modello del campione (vedere la tabella 1)-100 μL/pozzetto.
- Sigillare le piastre ELISA con pellicola trasparente e incubare a 37 °C per 1 ora.
- Diluire l'anticorpo secondario anti-IgG-HRP di topo (vedere la Tabella dei materiali) con PBST a 1:10.000.
- Lavare la piastra (tre cicli, ogni ciclo 300 μL). Quindi, aggiungere 100 μl dell'anticorpo secondario diluito a ciascun pozzetto e incubare la piastra a 37 °C per 40 minuti.
- Colorazione e terminazione: Lavare la piastra (cinque cicli, ogni ciclo 300 μL). Aggiungere la soluzione colorante 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidina (TMB) (100 μL; vedere la Tabella dei materiali) a ciascun pozzetto. Posizionare le piastre a 37 °C per 10 minuti al riparo dalla luce, quindi terminare immediatamente la reazione con 50 μL di 2 M H2SO4.
- Rilevare il valore di densità ottica (OD450) mediante un marcatore enzimatico (leggere il valore OD450 entro 15 minuti dalla terminazione).
Tabella 1: Sequenza di spiking ELISA e modello di diluizione.
