1. Valutazione della scissione o degradazione delle proteine nel virus dell'influenza A, cellule infettate da IAV da parte delle caspasi
- Seminare 3 x 105 cellule di Rene canino Madin-Darby (MDCK) o A549 per pozzetto in una piastra di coltura cellulare a 12 pozzetti.
nota: Se si utilizzano cellule MDCK, assicurarsi che l'anticorpo contro la proteina di interesse riconosca la sua specie canina.
- Seminare i pozzetti a coppie, cioè una coppia di controllo: un pozzetto per il campione simulato non infetto e uno per il campione simulato infetto, una coppia di test, un pozzetto per il campione A inibitore non infetto e uno per il campione A inibitore infetto. Aumenta il numero di coppie con ogni inibitore aggiuntivo.
- Incubare le cellule a 37 °C in atmosfera di CO2 al 5% per una notte.
- Il giorno successivo, infettare le cellule con IAV (un sottotipo H1N1 o un altro sottotipo).
- A tal fine, preparare l'inoculo virale diluendo lo stock virale in 400 μL di terreno essenziale minimo (MEM) privo di siero (vedi Tabella dei materiali) a una molteplicità di infezione (MOI) di 0,5-3,0 unità formanti placche (pfu)/cellula (un fattore del raddoppio del numero di cellule nel calcolo del MOI).
nota: Per infettare le cellule MDCK, integrare l'inoculo virale con tosil fenilalanile clorometilchetone (TPCK)-tripsina a una concentrazione finale di 1 μg/mL.
- Rimuovere il vecchio terreno di coltura dalle cellule (fase 1.3) e lavare le cellule con 1 mL/pozzetto di MEM 2x privo di siero.
- Aggiungere 400 μl di inoculo virale (passaggio 1.4.1) alle cellule e incubarle per 1 ora a 35 °C in un'atmosfera di anidride carbonica (CO2) al 5%.
- Nel frattempo, diluire un inibitore della caspasi (ad es. Z-DEVD-FMK), un inibitore del lisosoma (ad es. cloruro di ammonio, NH4Cl) o un inibitore del proteasoma (ad es. MG132) (vedi Tabella dei materiali) a una concentrazione finale di 40 μM, 20 mM o 10 μM, rispettivamente, in MEM senza siero (vedi Tabella dei materiali). Gli ultimi due inibitori fungono da controllo. Diluire un volume uguale del solvente (se diverso dall'acqua) utilizzato per ricostituire uno degli inibitori in un terreno privo di siero come finto.
- Rimuovere l'inoculo virale e lavare le cellule come al punto 1.5 (1x).
- Aggiungere il MEM senza siero, 1 mL/pozzetto, simulato o integrato con un inibitore, alle cellule e incubare le cellule come al punto 1.6. Questo punto temporale è considerato come un'infezione di 0 ore.
- Dopo 24 ore, prelevare le cellule raschiandole con uno stantuffo da siringa da 1 mL (lato in gomma) e trasferirle in una provetta in polipropilene da 1,5 mL.
- Centrifugare la provetta a 12.000 x g per 1-2 minuti a temperatura ambiente. Raccogliere il surnatante utilizzando una pipetta.
nota: Questo surnatante potrebbe essere scartato o utilizzato per un test di placca per misurare il titolo della progenie virale rilasciata.
- Lavare il pellet cellulare con 250 μl di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) mediante ricentrifugazione come al punto 1.11.
- Rimuovere il surnatante e lisare le cellule aggiungendo 80-100 μL di tampone di lisi cellulare (50 mM di Tris (idrossimetil) amminometano (THAM) cloridrato (Tris-HCl), pH 7,4, 150 mM di cloruro di sodio (NaCl), 0,5% di dodecil solfato di sodio (SDS), 0,5% di desossicolato di sodio, 1% di Triton X-100 e 1x cocktail di inibitori della proteasi, vedere la Tabella dei materiali) e vortexing.
- Riscaldare la provetta a 98 °C per 10 minuti per lisare completamente e preparare il lisato cellulare totale. Conservare i lisati a 4 °C per eseguire i passaggi 1,15-1,17 il giorno successivo, ma, per ottenere i migliori risultati, terminare questi passaggi lo stesso giorno.
- Stimare la quantità di proteine in ciascun campione utilizzando un kit di analisi da tavolo per l'acido bicinconninico (BCA) (vedere Tabella dei materiali).
- Risolvere quantità uguali di proteine da campioni non infetti e infetti mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide SDS standard (SDS-PAGE) insieme a marcatori di peso molecolare.
- Trasferire la proteina su una membrana di nitrocellulosa o difluoruro di polivinilidene (PVDF) (vedi Tabella dei materiali).
nota: La membrana in PVDF può fornire un elevato sfondo in alcuni imager western blot; Verificare la compatibilità.
- Eseguire il western blotting per rilevare la proteina di interesse utilizzando il metodo descritto altrove.
- Confrontare i livelli di proteine nelle corsie dei campioni infetti trattate con mock e inibitori.
nota: Se il livello di proteina si è ripreso nella corsia del campione infetta trattata con inibitore della caspasi, la proteina viene scissa o degradata dalle caspasi. In caso contrario, viene degradato dal lisosoma o dal proteasoma.
- Quantificare il recupero della proteina misurando la sua intensità di banda in ciascuna corsia da almeno tre repliche dello stesso esperimento e normalizzandola con la corrispondente banda di controllo del carico.
- Utilizzare qualsiasi imager contemporaneo e il software associato (vedere la Tabella dei materiali) per visualizzare i western blot e quantificare il recupero delle proteine.