Articolo metodologico

Valutazione della scissione mediata dalla caspasi delle proteine virali e dell'ospite nelle cellule infettate da virus

722 visualizzazioni

8 luglio 2025

In questo articolo

Abstract

Fonte: Husain, M. Identificazione delle caspasi e dei loro motivi che tagliano le proteine durante l'infezione da virus dell'influenza A.J. Vis. Exp. (2022)

Il video dimostra un metodo per valutare la scissione proteica mediata dalla caspasi nelle cellule infettate da virus. Dopo l'infezione virale, le caspasi si attivano e degradano varie proteine cellulari dell'ospite e nucleoproteine virali, mentre specifici inibitori delle caspasi prevengono questa degradazione, come confermato dal western blotting.

Protocollo

1. Valutazione della scissione o degradazione delle proteine nel virus dell'influenza A, cellule infettate da IAV da parte delle caspasi

  1. Seminare 3 x 105 cellule di Rene canino Madin-Darby (MDCK) o A549 per pozzetto in una piastra di coltura cellulare a 12 pozzetti.
    nota: Se si utilizzano cellule MDCK, assicurarsi che l'anticorpo contro la proteina di interesse riconosca la sua specie canina.
  2. Seminare i pozzetti a coppie, cioè una coppia di controllo: un pozzetto per il campione simulato non infetto e uno per il campione simulato infetto, una coppia di test, un pozzetto per il campione A inibit....

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Celle A549ATCCCodice: CRM-CCL-185Umano, epiteliale, polmonare
Cloruro di ammonioSigma-AldrichCodice: A9434
Inibitore della caspasi 3Sigma-AldrichCodice 264156-MConosciuto anche come "Inibitore II della caspasi-3 in soluzione - Calbiochem"
Cocktail completo di mini inibitori della proteasiRoche11836153001
Anticorpo anti-NP di capraDono di Richard Webby (St Jude Children's Research Hospital, Memphis, USA) a MH
Celle MDCKATCCCCL-34Cane, epiteliale, renale
MG132Sigma-AldrichVisualizzazione del materiale M7449
Mezzo minimo essenziale (MEM)ThermoFisher Scientifico11095080Aggiungere L-glutammina, antibiotici o altri integratori secondo necessità
Imager Odyssey Fc con software Image Studio Lite 5.2 LI-COROdyssey Fc è stato sostituito con Odyssey XF e il software Image Studio Lite è stato sostituito con il software Empiria Studio.
Kit per il dosaggio delle proteine Pierce BCAThermoFisher ScientificoCodice 23225
Membrana in nitrocellulosa Protran PremiumCytiva (Ex GE Healthcare)10600003
Anticorpo anti-actina di coniglioAbcamab8227
Anticorpo anti-cortactina di coniglioSegnalazione cellulare3502
Standard proteico precolorato SeeBlueThermoFisher ScientificoLC5625
Tris-HCl, NaCl, SDS, desossicolato di sodio, Triton X-100Merck
tripsina, trattata con TPCKSigma-Aldrich4370285

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Inibitore della caspasi 3scissione della nucleoproteina viraledegradazione delle proteine dell ospiteWestern blottingelettroforesi SDS PAGEinfezione da virus dell influenza Acellule MDCK A549tampone di lisi proteicarilevazione con anticorpi fluorescenti

Articoli correlati