Valutazione della scissione mediata dalla caspasi delle proteine virali e dell'ospite nelle cellule infettate da virus

Abstract

Fonte: Husain, M. Identificazione delle caspasi e dei loro motivi che tagliano le proteine durante l'infezione da virus dell'influenza A.J. Vis. Exp. (2022)

Il video dimostra un metodo per valutare la scissione proteica mediata dalla caspasi nelle cellule infettate da virus. Dopo l'infezione virale, le caspasi si attivano e degradano varie proteine cellulari dell'ospite e nucleoproteine virali, mentre specifici inibitori delle caspasi prevengono questa degradazione, come confermato dal western blotting.

Protocollo

1. Valutazione della scissione o degradazione delle proteine nel virus dell'influenza A, cellule infettate da IAV da parte delle caspasi

1. Seminare 3 x 10⁵ cellule di Rene canino Madin-Darby (MDCK) o A549 per pozzetto in una piastra di coltura cellulare a 12 pozzetti.
   nota: Se si utilizzano cellule MDCK, assicurarsi che l'anticorpo contro la proteina di interesse riconosca la sua specie canina.
2. Seminare i pozzetti a coppie, cioè una coppia di controllo: un pozzetto per il campione simulato non infetto e uno per il campione simulato infetto, una coppia di test, un pozzetto per il campione A inibit....

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Celle A549	ATCC	Codice: CRM-CCL-185	Umano, epiteliale, polmonare
Cloruro di ammonio	Sigma-Aldrich	Codice: A9434
Inibitore della caspasi 3	Sigma-Aldrich	Codice 264156-M	Conosciuto anche come "Inibitore II della caspasi-3 in soluzione - Calbiochem"
Cocktail completo di mini inibitori della proteasi	Roche	11836153001
Anticorpo anti-NP di capra			Dono di Richard Webby (St Jude Children's Research Hospital, Memphis, USA) a MH
Celle MDCK	ATCC	CCL-34	Cane, epiteliale, renale
MG132	Sigma-Aldrich	Visualizzazione del materiale M7449
Mezzo minimo essenziale (MEM)	ThermoFisher Scientifico	11095080	Aggiungere L-glutammina, antibiotici o altri integratori secondo necessità
Imager Odyssey Fc con software Image Studio Lite 5.2	LI-COR		Odyssey Fc è stato sostituito con Odyssey XF e il software Image Studio Lite è stato sostituito con il software Empiria Studio.
Kit per il dosaggio delle proteine Pierce BCA	ThermoFisher Scientifico	Codice 23225
Membrana in nitrocellulosa Protran Premium	Cytiva (Ex GE Healthcare)	10600003
Anticorpo anti-actina di coniglio	Abcam	ab8227
Anticorpo anti-cortactina di coniglio	Segnalazione cellulare	3502
Standard proteico precolorato SeeBlue	ThermoFisher Scientifico	LC5625
Tris-HCl, NaCl, SDS, desossicolato di sodio, Triton X-100	Merck
tripsina, trattata con TPCK	Sigma-Aldrich	4370285