1. Valutazione dell'attività antimicrobica
NOTA: Tutti i lavori che coinvolgono i batteri devono essere eseguiti in condizioni sterili per evitare la contaminazione del test o del laboratorio. Tutti i terreni devono essere sterilizzati in autoclave prima dell'uso e la plastica e le attrezzature come le pipette devono essere mantenute sterili. Si consiglia di lavorare in una cappa di biocontenimento (tipo 2).
- Striare le scorte di glicerolo di ceppi batterici appropriati per l'impalcatura antibiotica su agar brodo di lisogenia (LB, preparato secondo le istruzioni del produttore) e far crescere durante la notte a 37 °C.
nota: La scelta dei batteri per testare l'attività antibatterica deve essere effettuata in base all'impalcatura antibiotica utilizzata. Un intervallo rappresentativo di 5-10 batteri dovrebbe essere scelto tra le specie note per essere sensibili all'antibiotico, tenendo conto delle capacità logistiche del laboratorio. Se possibile, dovrebbero essere testati anche i batteri resistenti. Il protocollo indicato di seguito funzionerà sulla maggior parte dei batteri, ma controlla se sono necessarie condizioni speciali (ad es. CO2, mezzi speciali) e apporta le modifiche necessarie. I batteri analizzati con successo utilizzando queste condizioni includono stafilococchi, streptococchi, bacilli, E. coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa ed Enterococcus faecium.
- Prelevare una singola colonia dalla piastra e coltivare per una notte in 5 ml di brodo Mueller-Hinton aggiustato per cationi (CAMHB, preparato secondo le istruzioni del produttore) a 37 °C.
- Diluire le colture notturne ~40 volte in CAMHB e crescere fino a una fase di log medio, densità ottica a 600 nm (OD600) = 0,4-0,8, volume 5 mL).
- Preparare le soluzioni madre di ciascun antibiotico fluorescente a 1,28 mg/mL in acqua sterile e pipettare 10 μL di antibiotico nella prima colonna di una piastra a 96 pozzetti.
- Aggiungere 90 μl di CAMHB alla prima colonna e 50 μl a tutti gli altri pozzetti. Quindi, eseguire la diluizione seriale di 2 volte su tutta la piastra.
- Mescolare accuratamente, quindi diluire le colture in fase mid-log a ~106 unità formanti colonie (CFU)/mL e aggiungere 50 μL a tutti i pozzetti, per ottenere una concentrazione finale di ~5 x 105 CFU/mL.
volume di coltura (mL) = (volume del terreno in mL)/(OD600 x 1.000)
Ad esempio, per una coltura OD600 = 0,5 in un volume di terreno desiderato di 12 mL, aggiungere (12/(0,5 x 1.000) = 0,024 mL di coltura a 12 mL di terreno
- Coprire le piastre con i coperchi e incubare a 37 °C per 18-24 ore senza agitare.
- Ispezionare visivamente le piastre, con il MIC che è il pozzo con la concentrazione più bassa senza crescita visibile.
nota: Vedere la Tabella 1 per alcuni esempi di antibiotici fluorescenti attivi e inattivi.
2. Analisi dell'accumulo di sonde mediante spettrofotometria
NOTA: Questi tempi di centrifugazione sono stati ottimizzati per E. coli, quindi potrebbero essere necessarie lievi modifiche per altre specie. I dati rappresentativi per l'accumulo della sonda sono riportati per la sonda ciprofloxacina marcata con NBD.
- Strisciare le scorte di glicerolo dei ceppi batterici sull'agar LB e far crescere per una notte a 37 °C.
- Raccogli una singola colonia dal piatto e coltiva per una notte in LB a 37 °C.
- Diluire le colture durante la notte ~50 volte in terreno e crescere fino alla fase di log medio (OD600 = 0,4-0,8).
- Centrifugare le colture a 1.470 x g per 25 minuti e decantare il terreno.
- Risospendere i batteri in 1 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), quindi centrifugare a 1.470 x g per 15 minuti.
- Decantare il terreno e risospendere i pellet lavati in PBS fino a un OD finaledi 600 = 2.
- Se lo si desidera, aggiungere 10,1 μL di cianuro di carbonile 3-clorofenilidrazone (CCCP, 10 mM in PBS) a 1 mL di batteri (concentrazione finale 100 μM) e incubare a 37 °C per 10 min.
nota: La CCCP è un inibitore della pompa di efflusso. L'aggiunta di CCCP consentirà di esaminare l'impatto dell'efflusso.
- Centrifugare le colture a 18.000 x g per 4 minuti a 20 °C e decantare il terreno.
- Aggiungere 1 mL di soluzione antibiotica fluorescente (10-100 μM in PBS) al pellet e incubare a 37 °C per 30 min.
- Centrifugare le colture a 18.000 x g per 7 minuti a 4 °C e decantare il terreno.
- Risospendere i batteri in 1 mL di PBS freddo e ripetere il passaggio 2.9.
- Ripetere il passaggio 2.10 per un totale di 4 volte.
- Se lo si desidera, lisare i batteri aggiungendo 180 μL di tampone di lisi (20 mM Tris-HCl, pH 8,0 e 2 mM di EDTA sodico) e 70 μL di lisozima (72 mg/mL in H2O).
- Incubare a 37°C per 30 min, quindi congelare-scongelare 3 volte (-78 °C per 5 min, poi 34 °C per 15 min).
- Sonicare i campioni per 20 minuti, quindi riscaldare a 65 °C per 30 minuti.
- Centrifugare i campioni lisati (18.000 x g, 8 min), quindi filtrare attraverso una membrana filtrante da 10 kDa.
- Lavare il filtro 4 volte con 100 μL di acqua.
- Trasferire il lisato su una piastra nera a fondo piatto a 96 pozzetti e misurare l'intensità della fluorescenza su un lettore di piastre con lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione appropriate per il fluoroforo (ad esempio, 7-(dimetilammino)-2-osso-2H-cromon-4-ile [DMACA]: λex = 400 nm, λem = 490 nm; nitrobenzossadiazolo [NBD]: λex = 475 nm, λem = 545 nm).
nota: Vedere la Figura 1 per esempi di analisi spettrofotometriche di batteri utilizzando l'antibiotico ciprofloxacina marcato con NBD fluorescente.
