Non Laser Capture Microscopy approccio per la Microdissezione delle Regioni discreti cervello di topo per la totale isolamento di RNA e valle Next-Generation Sequencing e profili di espressione genica

Norman Atkins; Charlie M. Miller; Joseph R. Owens; Fred W. Turek

doi:10.3791/3125

Articolo metodologico

Non Laser Capture Microscopy approccio per la Microdissezione delle Regioni discreti cervello di topo per la totale isolamento di RNA e valle Next-Generation Sequencing e profili di espressione genica

DOI:

10.3791/3125

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13 novembre 2011

Norman Atkins¹ , Charlie M. Miller¹ , Joseph R. Owens¹ , Fred W. Turek¹

¹Center for Sleep and Circadian Biology, Northwestern University

In questo articolo

Sommario

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La profilazione dell'espressione dell'RNA di regioni discrete del cervello di topo richiede una strategia di raccolta dei tessuti precisa e ripetibile. Qui viene descritto un protocollo che utilizza sia il sezionamento coronale del cervello che la microdissezione assistita da carotaggio tissutale. La resa e la qualità dell'RNA totale ottenuto dai campioni risultanti conferma l'utilità del metodo delineato.

Abstract

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Come piattaforme tecnologiche, approcci come il sequenziamento di nuova generazione, il microarray e la qRT-PCR sono molto promettenti per ampliare la nostra comprensione dell'ampiezza della regolazione molecolare. Approcci più recenti, come il sequenziamento dell'RNA ad alta risoluzione (RNA-Seq)¹, forniscono informazioni nuove ed estese sull'espressione specifica del tessuto o dello stato, come i livelli di trascrizione relativi, lo splicing alternativo e i micro RNA^2-4. Le prospettive per l'impiego del metodo RNA-Seq nella profilazione comparativa dell'intero trascrittoma⁵ all'interno di tessuti discreti o tra gruppi fenotipicamente distinti di individui offrono nuove strade per chiarire i meccanismi molecolari coinvolti sia negli stati fisiologici normali che in quelli anormali. Recentemente, il profilo dell'intero trascrittoma è stato eseguito su tessuto cerebrale umano, identificando le differenze di espressione genica associate alla progressione della malattia⁶. Tuttavia, l'uso del sequenziamento di nuova generazione deve ancora essere più ampiamente integrato negli studi sui mammiferi.

Gli studi sull'espressione genica in modelli murini hanno riportato profili distinti all'interno di vari nuclei cerebrali utilizzando la microscopia a cattura laser (LCM) per l'escissione del campione^7,8. Mentre la LCM consente la raccolta del campione con precisione a singola cellula e regione cerebrale discreta, le rese di RNA totale relativamente basse dell'approccio LCM possono essere proibitive per l'RNA-Seq e altri approcci di profilazione nei tessuti cerebrali di topo e possono richiedere fasi di amplificazione del campione non ottimali. Qui, viene presentato un protocollo per la microdissezione e l'estrazione dell'RNA totale da regioni discrete del cervello di topo. I carotatori di tessuto a diametro impostato vengono utilizzati per isolare 13 tessuti da sezioni coronali seriali da 750 μm di un singolo cervello di topo. I campioni di micropunch tissutale vengono immediatamente congelati e archiviati. L'RNA totale è ottenuto dai campioni utilizzando la tecnologia di isolamento dell'RNA totale abilitata da biglie magnetiche. I campioni di RNA risultanti hanno una resa e una qualità adeguate per l'uso nella profilazione dell'espressione a valle. Questa strategia di microdissezione fornisce un'opzione praticabile alle strategie di raccolta dei campioni esistenti per ottenere l'RNA totale da regioni cerebrali discrete, aprendo possibilità per nuove scoperte sull'espressione genica.

Protocollo

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1. Impostazione e preparazione del campionamento

Integrare la soluzione salina bilanciata (EBSS) di Earle con bicarbonato di sodio (0,44 g per 100 ml di EBSS) e glucosio (0,884 g per 100 ml di EBSS)⁹. Trattare l'EBSS con DEPC (0,1 mL per 100 mL di EBSS) per almeno 12 ore a 37 °C in un flacone autoclavabile o in un pallone con tappo a vite.
Metti le pipette di vetro Pasteur da 5 3/4" in un bicchiere di vetro da 1000 ml e posiziona i pennelli da artista, con le setole rivolte verso l'alto, in un cilindro graduato di vetro da 100 ml. Aggiungere una quantità sufficiente di soluzione DEPC (0,1 mL per 100 mL ddH₂O) per coprire ....

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Discussione

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Ci sono molti passaggi critici in questo protocollo che meritano un'attenta attenzione e considerazione. La selezione del diametro appropriato del carotatore di tessuto deve essere determinata per rimuovere ciascuna rispettiva regione di interesse. Sebbene i diametri del carotaggio tissutale presentati nella Tabella 1 siano adatti per la raccolta delle regioni cerebrali elencate, ogni ricercatore dovrebbe determinare il carotaggio tissutale di dimensioni appropriate per una raccolta ottimale dei rispettivi tessuti di i.......

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Dichiarazioni

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Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato finanziato dalla Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) e dall'Army Research Office (ARO), numero di premio W911NF-10-1-006.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Isotemp 102 bagnomaria	Fisher Scientific	15-460-3Q
RNasi Zap	Ambion	AM9782
Rotatore da laboratorio (agitatore orbitale)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	2314 –- 1CEQ
Miscelatore di pellet	VWR international	47747-370
Pestello da 0,5 ml senza RNasi	VWR international	KT749521-0590
Pirocarbonato di dietil senza nucleasi (DEPC)	Sigma-Aldrich	D5758-50ML
Lamette da barba a doppio taglio	Stoelting Co.	51427
St– affettatrice per tessuti con micrometro manuale	Stoelting Co.	51425
2/0 Tondo d'artista' s pennello	Princeton Art Brush	4350R
Harris Uni-Core carotatore di tessuti (0,75 mm)	Ted Pella, Inc.	15072
Carotatore per tessuti Harris Uni-Core (1,0 mm)	Ted Pella, Inc.	15099
Carotatore per tessuti Harris Uni-Core (1,5 mm)	Ted Pella, Inc.	15075
Carotatore per tessuti Harris Uni-Core (2,0 mm)	Ted Pella, Inc.	15076
Ghigliottina	Braintree Scientific, Inc.	RG-100
DecapiCones	Braintree Scientific, Inc.	MDC-200
HyClone Earle' s soluzione salina bilanciata (EBSS)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	SH30029,02
Pipette da 25 mL	Corning	4489
epT.I.P.S. senza nucleasi Puntali per pipette LoRetention Dualfilter, 20 300 μ L	Eppendorf	0030 077.636
Tubi con tappo a vite TrakMates con tappi Thermo	Fisher Scientific, Inc.	3741
Lettore di codici a barre 2D wireless VisionMate	Thermo Fisher Scientific, Inc.	3122MTX
Lettore di codici a barre 2D a rack singolo VisionMate SR	Thermo Fisher Scientific, Inc.	3115
1-200 μ L puntali per pipette universali	Corning	4864
cellulari Cellstar	nucleasi	Greiner Bio-One	628160
Greiner Bio-One a 96 pozzetti in polistirene senza nucleasi Piastra per colture tissutali Cellstar, fondo a U	USA Scientific, Inc.	5665-0180	senza nucleasi
#4	Whatman, GE Healthcare	1004 150
Riempitrice per pipette di sicurezza a bulbo in silicone	Fisher Scientific	13-681-102A
Spettrofotometro NanoDrop 3300	Thermo Fisher Scientific, Inc.	ND-3300

Piastre per colture senza Carta da filtro

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pickrell, J. K. Understanding mechanisms underlying human gene expression variation with RNA sequencing. Nature. 464, 768-772 (2010).
Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq. J. Biomed. Biotec....

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Microdissection Brain Regions Total RNA Isolation Tissue Corer Technique RNA Free Environment Serial Tissue Sections Magnetic Bead Extraction Next Generation Sequencing Gene Expression Profiling Discrete Mouse Brain EBSS Preparation

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