Il profilo dell'espressione dell'RNA in regioni cerebrali murine discrete richiede una strategia di raccolta dei tessuti precisa e ripetibile. Viene qui descritto un protocollo che utilizza sia il sezionamento coronale del cervello sia la microdissezione assistita da corer tissutale. Il rendimento e la qualità dell'RNA totale ottenuti dai campioni risultanti confermano l'utilità del metodo delineato.
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Articolo metodologico
Non Laser Capture Microscopy approccio per la Microdissezione delle Regioni discreti cervello di topo per la totale isolamento di RNA e valle Next-Generation Sequencing e profili di espressione genica
In questo articolo
Sommario
Abstract
Come piattaforme tecnologiche, approcci come il sequenziamento di nuova generazione, il microarray e la qRT-PCR hanno un grande potenziale per ampliare la nostra comprensione dell'ampia regolazione molecolare. Approcci più recenti, come il sequenziamento dell'RNA ad alta risoluzione (RNA-Seq)1, forniscono informazioni nuove ed estese sull'espressione specifica di tessuto o di stato, quali i livelli relativi dei trascritti, lo splicing alternativo e i microRNA2-4. Le prospettive di applicazione del metodo RNA-Seq nel confronto del profilo dell'intero trascrittoma5 all'interno di tessuti distinti o tra gruppi di individui fenotipicamente diversi offrono nuove vie per chiarire i meccanismi molecolari coinvolti negli stati fisiologici sia normali che anomali. Recentemente, il profilo dell'intero trascrittoma è stato effettuato su tessuto cerebrale umano, identificando differenze nell'espressione genica associate al decorso della malattia6. Tuttavia, l'uso del sequenziamento di nuova generazione non è ancora stato ampiamente integrato negli studi su mammiferi.
Studi sull'espressione genica in modelli murini hanno riportato profili distinti all'interno di vari nuclei cerebrali, utilizzando la microscopia a cattura laser (LCM) per l'escissione del campione7,8. Sebbene la LCM consenta la raccolta di campioni con precisione a livello di singola cellula e di regioni cerebrali discrete, i rendimenti relativamente bassi di RNA totale ottenuti con questo approccio possono rappresentare un ostacolo per l'RNA-Seq e altre tecniche di profilazione nei tessuti cerebrali murini, richiedendo talvolta passaggi di amplificazione del campione subottimali. In questo lavoro viene presentato un protocollo per la microdissezione ed estrazione di RNA totale da regioni cerebrali murine discrete. Vengono utilizzati corer tissutali di diametro prefissato per isolare 13 tessuti da sezioni coronali seriali da 750 μm di un singolo cervello murino. I campioni ottenuti mediante microprelievo tissutale vengono immediatamente congelati e archiviati. L'RNA totale viene ottenuto dai campioni mediante tecnologia di isolamento di RNA totale basata su microsfere magnetiche. Gli RNA risultanti presentano resa e qualità adeguate per l'utilizzo in analisi di profilazione dell'espressione genica successive. Questa strategia di microdissezione rappresenta un'opzione praticabile rispetto alle attuali metodiche di raccolta dei campioni per ottenere RNA totale da regioni cerebrali discrete, aprendo nuove possibilità per scoperte nell'espressione genica.
Protocollo
1. Configurazione e preparazione del campionamento
- Integrare la soluzione salina equilibrata di Earle (EBSS) con bicarbonato di sodio (0,44 g per 100 mL di EBSS) e glucosio (0,884 g per 100 mL di EBSS)9. Trattare l'EBSS con DEPC (0,1 mL per 100 mL di EBSS) per almeno 12 ore a 37 °C in un contenitore o flacone autoclavabile con tappo a vite.
- Posizionare 5 pipette di Pasteur in vetro da 5 ¾" in un becher di vetro da 1000 mL e inserire i pennelli da disegno, con le setole rivolte verso l'alto, in un cilindro graduato di vetro da 100 mL. Aggiungere una quantità sufficiente di soluzione di DEPC (0,1 mL per 100 mL di ddH2O) per c....
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Discussione
In questo protocollo esistono molti passaggi critici che richiedono un'attenta considerazione e attenzione. La scelta del diametro appropriato del corer per tessuti deve essere determinata in base alla rimozione di ciascuna specifica regione di interesse. Sebbene i diametri del corer per tessuti riportati nella Tabella 1 siano adatti al prelievo delle regioni cerebrali elencate, ogni ricercatore dovrebbe stabilire le dimensioni ottimali del corer per un prelievo efficiente del proprio tessuto (o dei propri tessuti) di in.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarato.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato dalla Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) e dall'Army Research Office (ARO), numero del contributo W911NF-10-1-006.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Bagno termostatato Isotemp 102 | Fisher Scientific | 15-460-3Q | |
| RNase Zap | Ambion | AM9782 | |
| Agitatore orbitale da laboratorio | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 2314 –- 1CEQ | |
| Miscelatore per pellet | VWR international | 47747-370 | |
| Pestello da 0,5 mL privo di RNasi | VWR international | KT749521-0590 | Privato di nucleasi |
| Diethyl pyrocarbonato (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758-50ML | |
| Lame di rasoio a doppio taglio | Stoelting Co. | 51427 | |
| St–Affettatrice per tessuti con micrometro manuale | Stoelting Co. | 51425 | |
| Artista 2/0 tondo’spazzola s | Princeton Art Brush | 4350R | |
| Harris Uni-Core, corer per tessuti (0,75 mm) | Ted Pella, Inc. | 15072 | |
| Harris Uni-Core, corer per tessuti (1,0 mm) | Ted Pella, Inc. | 15099 | |
| Harris Uni-Core, corer per tessuti (1,5 mm) | Ted Pella, Inc. | 15075 | |
| Harris Uni-Core, corer per tessuti (2,0 mm) | Ted Pella, Inc. | 15076 | |
| Ghigliottina | Braintree Scientific, Inc. | RG-100 | |
| DecapiConi | Braintree Scientific, Inc. | MDC-200 | |
| HyClone Earle’una soluzione equilibrata di sali (EBSS) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30029.02 | |
| pipette da 25 mL | Corning | 4489 | Privato di nucleasi |
| epT.I.P.S. Punte per pipetta LoRetention con doppio filtro, 20 — 300 μL | Eppendorf | 0030 077.636 | |
| Tubi con tappo a vite TrakMates | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3741 | |
| Lettore di codici a barre 2D wireless VisionMate | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3122MTX | |
| Lettore di codici a barre 2D VisionMate SR con singolo alloggiamento | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3115 | |
| 1-200 μPunte per pipetta universali | Corning | 4864 | Privato di nucleasi |
| Piatti per coltura cellulare Cellstar | Greiner Bio-One | 628160 | Privato di nucleasi |
| Piastra da coltura cellulare Greiner Bio-One in polistirene, 96 pozzetti, fondo rotondo | USA Scientific, Inc. | 5665-0180 | Privato di nucleasi |
| #4 Carta da filtro | Whatman, GE Healthcare | 1004 150 | |
| Pompetta per pipette di sicurezza a bulbo in silicone | Fisher Scientific | 13-681-102A | |
| NanoDrop 3300 Spettrofotometro | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ND-3300 |
Riferimenti
- Pickrell, J. K. Understanding mechanisms underlying human gene expression variation with RNA sequencing. Nature. 464, 768-772 (2010).
- Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq. J. Biomed. Biotec....
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Ristampe e permessi
