Non Laser Capture Microscopy approccio per la Microdissezione delle Regioni discreti cervello di topo per la totale isolamento di RNA e valle Next-Generation Sequencing e profili di espressione genica

Sommario

La profilazione dell'espressione dell'RNA di regioni discrete del cervello di topo richiede una strategia di raccolta dei tessuti precisa e ripetibile. Qui viene descritto un protocollo che utilizza sia il sezionamento coronale del cervello che la microdissezione assistita da carotaggio tissutale. La resa e la qualità dell'RNA totale ottenuto dai campioni risultanti conferma l'utilità del metodo delineato.

Abstract

Come piattaforme tecnologiche, approcci come il sequenziamento di nuova generazione, il microarray e la qRT-PCR sono molto promettenti per ampliare la nostra comprensione dell'ampiezza della regolazione molecolare. Approcci più recenti, come il sequenziamento dell'RNA ad alta risoluzione (RNA-Seq)¹, forniscono informazioni nuove ed estese sull'espressione specifica del tessuto o dello stato, come i livelli di trascrizione relativi, lo splicing alternativo e i micro RNA^2-4. Le prospettive per l'impiego del metodo RNA-Seq nella profilazione comparativa dell'intero trascrittoma⁵ all'interno di tessuti discreti o tra gruppi fenotipicamente distinti di individui offrono nuove strade per chiarire i meccanismi molecolari coinvolti sia negli stati fisiologici normali che in quelli anormali. Recentemente, il profilo dell'intero trascrittoma è stato eseguito su tessuto cerebrale umano, identificando le differenze di espressione genica associate alla progressione della malattia⁶. Tuttavia, l'uso del sequenziamento di nuova generazione deve ancora essere più ampiamente integrato negli studi sui mammiferi.

Gli studi sull'espressione genica in modelli murini hanno riportato profili distinti all'interno di vari nuclei cerebrali utilizzando la microscopia a cattura laser (LCM) per l'escissione del campione^7,8. Mentre la LCM consente la raccolta del campione con precisione a singola cellula e regione cerebrale discreta, le rese di RNA totale relativamente basse dell'approccio LCM possono essere proibitive per l'RNA-Seq e altri approcci di profilazione nei tessuti cerebrali di topo e possono richiedere fasi di amplificazione del campione non ottimali. Qui, viene presentato un protocollo per la microdissezione e l'estrazione dell'RNA totale da regioni discrete del cervello di topo. I carotatori di tessuto a diametro impostato vengono utilizzati per isolare 13 tessuti da sezioni coronali seriali da 750 μm di un singolo cervello di topo. I campioni di micropunch tissutale vengono immediatamente congelati e archiviati. L'RNA totale è ottenuto dai campioni utilizzando la tecnologia di isolamento dell'RNA totale abilitata da biglie magnetiche. I campioni di RNA risultanti hanno una resa e una qualità adeguate per l'uso nella profilazione dell'espressione a valle. Questa strategia di microdissezione fornisce un'opzione praticabile alle strategie di raccolta dei campioni esistenti per ottenere l'RNA totale da regioni cerebrali discrete, aprendo possibilità per nuove scoperte sull'espressione genica.

Protocollo

1. Impostazione e preparazione del campionamento

1. Integrare la soluzione salina bilanciata (EBSS) di Earle con bicarbonato di sodio (0,44 g per 100 ml di EBSS) e glucosio (0,884 g per 100 ml di EBSS)⁹. Trattare l'EBSS con DEPC (0,1 mL per 100 mL di EBSS) per almeno 12 ore a 37 °C in un flacone autoclavabile o in un pallone con tappo a vite.
2. Metti le pipette di vetro Pasteur da 5 3/4" in un bicchiere di vetro da 1000 ml e posiziona i pennelli da artista, con le setole rivolte verso l'alto, in un cilindro graduato di vetro da 100 ml. Aggiungere una quantità sufficiente di soluzione DEPC (0,1 mL per 100 mL ddH₂O) per coprire rispettivamente le pipette e le spazzole. Coprire il becher e il cilindro graduato con un foglio di alluminio e incubare per almeno 12 ore a 37 °C.
3. Dopo 12 ore di incubazione con DEPC, riscaldare tutti i materiali trattati con DEPC a una temperatura >100 °C per almeno 15 minuti. Togliere l'EBSS e raffreddarlo a temperatura ambiente prima di riporlo a 4 °C. Versare ddH₂O lontano dal becher e dal cilindro graduato; continuare a incubare a >100 °C fino a quando i materiali sono asciutti. Rimuovere, raffreddare a temperatura ambiente e conservare per un uso successivo.
4. Il giorno dell'esperimento, trattare tutte le superfici di lavoro con RNaseZap.
5. Posizionare e mantenere EBSS in un bagnomaria impostato a 40 °C. Per tamponare e ossigenare l'EBSS, infiltrarlo con il 95%/5% di O₂/CO₂ inserendo il tubo del gas in una pipetta Pasteur priva di RNasi e inserendo la pipetta nell'EBSS. Coprire l'apertura del contenitore EBSS.
6. Impostare un'affettatrice di tessuti Stoelting da utilizzare nel sezionamento seriale del tessuto cerebrale. Trattare le superfici superiore e inferiore dell'affettatrice con RNaseZap. Attacca un pezzo rettangolare di carta da filtro Whatman #4 alla superficie in plexiglass del tritatutto. Attacca una lama di rasoio a doppio taglio al braccio del tritatutto. Impostare il micrometro su zero e regolare l'altezza minima del braccio del tritatutto per consentire alla lama del rasoio di tagliare la carta da filtro, ma non la lastra di plexiglass.
7. Raccogli tutti i materiali aggiuntivi necessari per la microdissezione, tra cui piastre per colture cellulari da 60x15 mm prive di RNasi, carotatori di tessuti Harris Uni-Core, puntali per micropipette da 200 μL privi di RNasi da fissare ai tubi del gas per l'ossigenazione EBSS delle sezioni coronali del cervello durante la punzonatura dei microcampioni, forbici curve, ghiaccio secco e provette per la raccolta dei tessuti. Posizionare i tubi sul ghiaccio secco.

2. Rimozione del cervello e sezionamento coronale

1. Metti il topo in un DecapiCono e decapitalo usando una ghigliottina per roditori. Togliere la testa dal DecapiCono e posizionarla su una superficie piana. Usando un bisturi, tagliare la pelle lungo la linea mediana del cranio iniziando circa 3 mm caudale fino alla narice. Staccare lateralmente i lembi di pelle all'indietro per esporre il cranio e le orbite.
2. Usando le forbici curve, taglia entrambi i nervi ottici, recidendo la loro connessione con l'occhio. Aprire la cavità cranica rompendo con cura le ossa occipitali e interparietali e rimuovendo le ossa dorsali, parietali e frontali. Usando un rongeur osseo, rompere le ossa nasali e lacrimali per esporre i bulbi olfattivi. Usa le forbici curve per tagliare i bulbi olfattivi lontano dal cervello rostrale. Rimuovere l'intero cervello con il rombencefalo intatto. Posizionare il cervello nella parte superiore di una piastra per colture cellulari Cellstar di 60 x 15 mm, priva di RNasi. Trasferire sul piano di lavoro per il campionamento dei tessuti.
3. Utilizzare una pipetta priva di RNasi per inumidire in modo conservativo la carta da filtro sul tritatutto collegato con EBSS. Inumidire il tessuto cerebrale con EBSS.
4. Trasferisci il cervello nel tritatessuti e imposta l'orientamento appropriato. Nota: il cervello deve essere posizionato con la superficie ventrale appoggiata sulla carta da filtro. La linea mediana (fessura interemisferica) dovrebbe essere perpendicolare alla lama del tritatutto e il bordo rostrale del cervello dovrebbe appoggiarsi alla lama.
5. Usa un pennello da artista trattato con DEPC per mantenere fermo il cervello applicando una leggera pressione sulla superficie dorsale del cervello. Tenendo fermo il cervello, sollevare la leva del portalama a circa 4-5 cm sopra la superficie del tessuto dorsale e tenerla in questa posizione. Rimuovere lo spazzolino dalla superficie del cervello e comporre 750 μm utilizzando il micrometro. Lasciare cadere la leva, tagliando il tessuto e creando una sezione coronale di 750 μm.
6. Mentre la lama del tritatutto rimane ferma, utilizzare un movimento rotatorio con il pennello da artista per far scorrere delicatamente la sezione di tessuto lontano dalla superficie della lama. Posizionare immediatamente la sezione di tessuto nell'EBSS ossigenato nella capsula di Petri. Un secondo investigatore può iniziare dal passaggio 3.1.
7. Ripetere i passaggi 2.5 e 2.6 fino a quando le sezioni seriali del cervello non sono state ottenute su tutto il piano rostro-caudale.

3. Microdissezione della regione cerebrale

1. Regolare l'illuminazione per garantire che l'illuminazione del campione non venga ostruita durante la microdissezione tissutale. Regolare la posizione e il flusso della miscela al 95%/5% di O₂/CO₂ per mantenere un ambiente tamponato e ossigenato per il tessuto durante la microdissezione.
2. Identificare la sezione del cervello coronale che include la regione di interesse. Orienta la sezione del cervello sul fondo della capsula di Petri usando un pennello da artista. Selezionare il carotatore di tessuto con il diametro appropriato in base alla Tabella 1 o ad altri riferimenti. Tenendo in posizione la sezione di tessuto coronale con il pennello da artista, portare la punta di taglio del carotatore di tessuto verso il basso sulla superficie della sezione di tessuto.
3. Durante l'applicazione della pressione, premere con decisione la punta del carotatore di tessuto attraverso la sezione di tessuto e verso il basso sul fondo della capsula di Petri. Utilizzare un movimento circolare rotatorio per assicurarsi che la regione di interesse sia stata dissociata dal tessuto circostante. Sollevare con cautela il carotatore di tessuto dalla sezione di tessuto e liberare il micropunzone, permettendogli di galleggiare nell'EBSS.
4. Utilizzando un pennello da artista, depositare immediatamente il micropunch in tessuto in una provetta stabile a -80 °C conservata su ghiaccio secco. Il tessuto deve aderire facilmente al lato del tubo. Rimettere la provetta contenente il microcampione nel ghiaccio secco.
5. Ripetere i passaggi 3.2 - 3.4 per ogni regione del cervello di interesse.

4. Archiviazione dei tessuti

1. Una volta completata la microdissezione, utilizzare il sistema di scansione VisionMate per registrare i rispettivi codici a barre per ogni provetta TrakMates contenente campione. Una volta riempito il rack per provette TrakMates a 96 slot, eseguire rapidamente la scansione del rack e posizionare immediatamente i campioni di tessuto in un congelatore a -80 °C fino all'estrazione dell'RNA.

5. Estrazione dell'RNA totale

1. Preparare un'area di lavoro priva di RNasi usando RNaseZap. Preparare una quantità sufficiente di miscela di perline magnetiche e soluzione di lisi/legante come descritto nel protocollo di isolamento dell'RNA totale MagMAX-96¹⁰.
2. Rimuovere i campioni di tessuto dal congelatore a -80 °C e posizionare le provette direttamente sul ghiaccio secco.
3. Aggiungere 100 μl della soluzione di lisi/legante a una provetta TrakMates contenente campioni. Collegare un pestello da 0,5 ml senza nucleasi al miscelatore di pellet e omogeneizzare il tessuto. Utilizzando un puntale per pipetta privo di nucleasi a bassa ritenzione, trasferire il campione omogeneizzato in un pozzetto su una piastra di coltura tissutale a fondo rotondo da 96 pozzetti. Aggiungere immediatamente 60 μl di isopropanolo al 100% al campione utilizzando un puntale per pipetta privo di nucleasi a bassa ritenzione e mescolare pipettando su e giù 3-4 volte.
4. Aggiungere 20 μl di Bead Mix al campione utilizzando un puntale per pipetta privo di nucleasi a bassa ritenzione. Mescolare pipettando su e giù 3-4 volte.
5. Ripetere i passaggi 5.3-5.4 per tutti i campioni di tessuto.
6. Seguire i passaggi del protocollo di isolamento dell'RNA totale MagMAX-96 a partire da III.A.2 per completare l'estrazione dell'RNA totale. nota: Sono disponibili in commercio altri kit di isolamento dell'RNA totale abilitati a biglie magnetiche; Tuttavia, non sono stati esaminati in questo studio. Fare riferimento ai manuali del kit del produttore per i dettagli sull'isolamento totale dell'RNA utilizzando i rispettivi prodotti.
7. Misura la purezza e la concentrazione dell'RNA totale risultante utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop 3300 o altre tecnologie di spettrofotometro/fluorimetro di piccolo volume.

6. Risultati rappresentativi:

Regione/nucleo del cervello Diametro del carotaggio dei tessuti (mm) RNA totale (ng/μL) Rapporto 260/280 Corteccia frontale 2.0 Ore 27.03 1.99 Nucleus accumbens 1.0 6.26 2.77 Striato 1.5 Ore 27.94 2.19 Corteccia cingolata 1.5 Ore 29.05 2.07 Ipotalamo - Nucleo paraventricolare / Nucleo soprachiasmatico (PVN/SCN) 2.0 40.34 2.03 talamo 2.0 Ore 34.40 Ore 2.00 Ipotalamo - Nucleo dorsomediale / Nucleo ventromediale (DMH/VMH) 2.0 44,83 2.05 amigdala 1.0 Ore 10.06 1.89 Ippocampo - Ca 2/3 1.5 7.31 2.32 Ippocampo - Ca1/Giro dentato 1.5 5.20 2.24 Grigio periacqueduttale 1.0 48.21 2.02 Nucleo del rafe dorsale 1.0 6.56 2.18 Formazione reticolare 2.0 35.35 2.27

Tabella 1. Enumerazione delle regioni cerebrali di topo microdissezionate con rispettivi diametri ottimali del carotatore tissutale, resa e purezza rappresentative dell'RNA totale. Le 13 regioni cerebrali microdissezionate, elencate in ordine rostro-caudale, variano in dimensioni e orientamento. Il micropunch PVN/SCN comprende il nucleo paraventricolare anteromediale, porzioni del nucleo periventricolare, la zona sub-paraventricolare e altri neuroni parvocellulari. Il micropunch del talamo include nuclei talamici anteriori situati sullo stesso piano coronale della regione del micropunch PVN/SCN. Il micropunch DMH/VMH include nuclei magnocellulari accessori e altri neuroni parvocellulari situati tra il nucleo dorsomediale e il nucleo ventromediale. Il campione di amigdala comprende sia la sottoregione centrale che quella basolaterale. La resa dell'RNA e i rapporti 260/280 sono valori singoli ottenuti dai rispettivi campioni di microdissezione per dimostrare le letture ottenute da ciascuna regione del cervello.

Discussione

Ci sono molti passaggi critici in questo protocollo che meritano un'attenta attenzione e considerazione. La selezione del diametro appropriato del carotatore di tessuto deve essere determinata per rimuovere ciascuna rispettiva regione di interesse. Sebbene i diametri del carotaggio tissutale presentati nella Tabella 1 siano adatti per la raccolta delle regioni cerebrali elencate, ogni ricercatore dovrebbe determinare il carotaggio tissutale di dimensioni appropriate per una raccolta ottimale dei rispettivi tessuti di i...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Isotemp 102 bagnomaria	Fisher Scientific	15-460-3Q
RNasi Zap	Ambion	AM9782
Rotatore da laboratorio (agitatore orbitale)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	2314 –- 1CEQ
Miscelatore di pellet	VWR international	47747-370
Pestello da 0,5 ml senza RNasi	VWR international	KT749521-0590
Pirocarbonato di dietil senza nucleasi (DEPC)	Sigma-Aldrich	D5758-50ML
Lamette da barba a doppio taglio	Stoelting Co.	51427
St– affettatrice per tessuti con micrometro manuale	Stoelting Co.	51425
2/0 Tondo d'artista' s pennello	Princeton Art Brush	4350R
Harris Uni-Core carotatore di tessuti (0,75 mm)	Ted Pella, Inc.	15072
Carotatore per tessuti Harris Uni-Core (1,0 mm)	Ted Pella, Inc.	15099
Carotatore per tessuti Harris Uni-Core (1,5 mm)	Ted Pella, Inc.	15075
Carotatore per tessuti Harris Uni-Core (2,0 mm)	Ted Pella, Inc.	15076
Ghigliottina	Braintree Scientific, Inc.	RG-100
DecapiCones	Braintree Scientific, Inc.	MDC-200
HyClone Earle' s soluzione salina bilanciata (EBSS)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	SH30029,02
Pipette da 25 mL	Corning	4489
epT.I.P.S. senza nucleasi Puntali per pipette LoRetention Dualfilter, 20 300 μ L	Eppendorf	0030 077.636
Tubi con tappo a vite TrakMates con tappi Thermo	Fisher Scientific, Inc.	3741
Lettore di codici a barre 2D wireless VisionMate	Thermo Fisher Scientific, Inc.	3122MTX
Lettore di codici a barre 2D a rack singolo VisionMate SR	Thermo Fisher Scientific, Inc.	3115
1-200 μ L puntali per pipette universali	Corning	4864
cellulari Cellstar	nucleasi	Greiner Bio-One	628160
Greiner Bio-One a 96 pozzetti in polistirene senza nucleasi Piastra per colture tissutali Cellstar, fondo a U	USA Scientific, Inc.	5665-0180	senza nucleasi
#4	Whatman, GE Healthcare	1004 150
Riempitrice per pipette di sicurezza a bulbo in silicone	Fisher Scientific	13-681-102A
Spettrofotometro NanoDrop 3300	Thermo Fisher Scientific, Inc.	ND-3300