Il profilo dell'espressione dell'RNA in regioni cerebrali murine discrete richiede una strategia di raccolta dei tessuti precisa e ripetibile. Viene qui descritto un protocollo che utilizza sia il sezionamento coronale del cervello sia la microdissezione assistita da corer tissutale. Il rendimento e la qualità dell'RNA totale ottenuti dai campioni risultanti confermano l'utilità del metodo delineato.
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Articolo metodologico
Non Laser Capture Microscopy approccio per la Microdissezione delle Regioni discreti cervello di topo per la totale isolamento di RNA e valle Next-Generation Sequencing e profili di espressione genica
In questo articolo
Sommario
Abstract
Come piattaforme tecnologiche, approcci come il sequenziamento di nuova generazione, il microarray e la qRT-PCR hanno un grande potenziale per ampliare la nostra comprensione dell'ampia regolazione molecolare. Approcci più recenti, come il sequenziamento dell'RNA ad alta risoluzione (RNA-Seq)1, forniscono informazioni nuove ed estese sull'espressione specifica di tessuto o di stato, quali i livelli relativi dei trascritti, lo splicing alternativo e i microRNA2-4. Le prospettive di applicazione del metodo RNA-Seq nel confronto del profilo dell'intero trascrittoma5 all'interno di tessuti distinti o tra gruppi di individui fenotipicamente diversi offrono nuove vie per chiarire i meccanismi molecolari coinvolti negli stati fisiologici sia normali che anomali. Recentemente, il profilo dell'intero trascrittoma è stato effettuato su tessuto cerebrale umano, identificando differenze nell'espressione genica associate al decorso della malattia6. Tuttavia, l'uso del sequenziamento di nuova generazione non è ancora stato ampiamente integrato negli studi su mammiferi.
Studi sull'espressione genica in modelli murini hanno riportato profili distinti all'interno di vari nuclei cerebrali, utilizzando la microscopia a cattura laser (LCM) per l'escissione del campione7,8. Sebbene la LCM consenta la raccolta di campioni con precisione a livello di singola cellula e di regioni cerebrali discrete, i rendimenti relativamente bassi di RNA totale ottenuti con questo approccio possono rappresentare un ostacolo per l'RNA-Seq e altre tecniche di profilazione nei tessuti cerebrali murini, richiedendo talvolta passaggi di amplificazione del campione subottimali. In questo lavoro viene presentato un protocollo per la microdissezione ed estrazione di RNA totale da regioni cerebrali murine discrete. Vengono utilizzati corer tissutali di diametro prefissato per isolare 13 tessuti da sezioni coronali seriali da 750 μm di un singolo cervello murino. I campioni ottenuti mediante microprelievo tissutale vengono immediatamente congelati e archiviati. L'RNA totale viene ottenuto dai campioni mediante tecnologia di isolamento di RNA totale basata su microsfere magnetiche. Gli RNA risultanti presentano resa e qualità adeguate per l'utilizzo in analisi di profilazione dell'espressione genica successive. Questa strategia di microdissezione rappresenta un'opzione praticabile rispetto alle attuali metodiche di raccolta dei campioni per ottenere RNA totale da regioni cerebrali discrete, aprendo nuove possibilità per scoperte nell'espressione genica.
Protocollo
1. Configurazione e preparazione del campionamento
- Integrare la soluzione salina equilibrata di Earle (EBSS) con bicarbonato di sodio (0,44 g per 100 mL di EBSS) e glucosio (0,884 g per 100 mL di EBSS)9. Trattare l'EBSS con DEPC (0,1 mL per 100 mL di EBSS) per almeno 12 ore a 37 °C in un contenitore o flacone autoclavabile con tappo a vite.
- Posizionare 5 pipette di Pasteur in vetro da 5 ¾" in un becher di vetro da 1000 mL e inserire i pennelli da disegno, con le setole rivolte verso l'alto, in un cilindro graduato di vetro da 100 mL. Aggiungere una quantità sufficiente di soluzione di DEPC (0,1 mL per 100 mL di ddH2O) per coprire rispettivamente le pipette e i pennelli. Coprire il becher e il cilindro graduato con carta d'alluminio e incubare per almeno 12 ore a 37 °C.
- Dopo l'incubazione di 12 ore con DEPC, riscaldare tutti i materiali trattati con DEPC a una temperatura >100 °C per almeno 15 minuti. Rimuovere l'EBSS e farlo raffreddare a temperatura ambiente prima di conservarlo a 4 °C. Versare l'acqua ddH2O lontano dal becher e dal cilindro graduato; continuare l'incubazione a >100 °C finché i materiali non saranno completamente asciutti. Rimuoverli, farli raffreddare a temperatura ambiente e conservarli per un uso successivo.
- Nel giorno dell'esperimento, trattare tutte le superfici di lavoro con RNaseZap.
- Posizionare e mantenere l'EBSS in un bagno termostatato regolato a 40 °C. Per tamponare e ossigenare l'EBSS, saturare con una miscela di gas 95%/5% O2/CO2 inserendo un tubo del gas in una pipetta di Pasteur priva di RNasi e immergendo la pipetta nell'EBSS. Coprire l'apertura del contenitore dell'EBSS.
- Preparare un tagliacampione tissutale Stoelting per sezionare in serie il tessuto cerebrale. Trattare le superfici superiore e inferiore del tagliacampione con RNaseZap. Fissare un pezzo rettangolare di carta da filtro Whatman n. 4 sulla superficie in plexiglass del tagliacampione. Montare una lama doppio-tagliente sul braccio del tagliacampione. Impostare il micrometro su zero e regolare l'altezza minima del braccio in modo che la lama tagli la carta da filtro senza danneggiare la piastra in plexiglass.
- Raccogliere tutti gli altri materiali necessari per la microdissezione, inclusi piatti per colture cellulari RNasi-free da 60x15 mm, corer tissutali Harris Uni-Core, puntali per micropipetta da 200 μL privi di RNasi da applicare ai tubi del gas per l'ossigenazione dell'EBSS durante il prelievo di campioni da sezioni coronali del cervello, forbici curve, ghiaccio secco e provette per il recupero del tessuto. Posizionare le provette sul ghiaccio secco.
2. Rimozione del cervello e sezione coronale
- Posizionare il topo in un DecapiCone e decapitarlo utilizzando una ghigliottina per roditori. Rimuovere la testa dal DecapiCone e appoggiarla su una superficie piana. Con un bisturi, praticare un'incisione cutanea lungo la linea mediana del cranio, a partire da circa 3 mm caudalmente alle narici. Sollevare lateralmente i lembi cutanei per esporre il cranio e le orbite oculari.
- Utilizzando forbici curve, recidere i due nervi ottici, interrompendo la loro connessione con l'occhio. Aprire la cavità cranica rompendo con attenzione le ossa occipitale e interparietale ed eliminando le ossa parietali dorsali e frontali. Con un rongeur osseo, frantumare le ossa nasali e lacrimali per esporre i bulbi olfattivi. Usare le forbici curve per staccare i bulbi olfattivi dalla porzione rostrale del cervello. Rimuovere l'intero cervello mantenendo intatto il metencefalo. Posizionare il cervello nella parte superiore di una piastra per colture cellulari Cellstar da 60 x 15 mm, priva di RNasi. Trasferire sulla superficie di lavoro per il campionamento del tessuto.
- Utilizzare una pipetta priva di RNasi per inumidire moderatamente la carta filtro fissata al taglia-tessuti con EBSS. Inumidire il tessuto cerebrale con EBSS.
- Trasferire il cervello sul taglia-tessuti e posizionarlo correttamente. Nota: il cervello deve essere posizionato con la superficie ventrale appoggiata sulla carta filtro. La linea mediana (fessura interemisferica) deve essere perpendicolare alla lama del taglia-tessuti, e il margine rostrale del cervello deve aderire alla lama.
- Utilizzare un pennello da artista trattato con DEPC per mantenere fermo il cervello applicando una leggera pressione sulla superficie dorsale. Mentre si tiene fermo il cervello, sollevare la leva del supporto della lama di circa 4-5 cm al di sopra della superficie dorsale del tessuto e mantenerla in questa posizione. Rimuovere il pennello dalla superficie cerebrale e regolare la micrometrica su 750 μm. Lasciare cadere la leva, tagliando il tessuto e producendo una sezione coronale di 750 μm.
- Mantenendo la lama del taglia-tessuti ferma, utilizzare un movimento rotatorio del pennello da artista per spostare delicatamente la sezione di tessuto dalla superficie della lama. Posizionare immediatamente la sezione di tessuto nell'EBSS ossigenato presente nella piastra di Petri. Un secondo operatore può iniziare dal passaggio 3.1.
- Ripetere i passaggi 2.5 e 2.6 fino a ottenere sezioni seriali del cervello lungo l'intero piano rostro-caudale.
3. Microdissezione di regioni cerebrali
- Regolare l'illuminazione per garantire che l'illuminazione del campione non venga ostacolata durante la microdissezione del tessuto. Regolare la posizione e il flusso della miscela 95%/5% di O2/CO2 per mantenere un ambiente tamponato e ossigenato per il tessuto durante la microdissezione.
- Individuare la sezione cerebrale coronale che comprende la regione di interesse. Orientare la sezione cerebrale in posizione piatta sul fondo della piastra di Petri utilizzando un pennello da artista. Selezionare il corer per tessuti con il diametro appropriato in base alla Tabella 1 o ad altre referenze. Mentre si tiene ferma la sezione di tessuto coronale con il pennello da artista, abbassare la punta del corer sulla superficie della sezione di tessuto.
- Applicando pressione, spingere la punta del corer attraverso la sezione di tessuto fino a farla aderire saldamente al fondo della piastra di Petri. Utilizzare un movimento circolare rotatorio per assicurarsi che la regione di interesse sia stata dissociata dal tessuto circostante. Sollevare con attenzione il corer dalla sezione di tessuto e rilasciare il microprelievo, permettendogli di galleggiare nell'EBSS.
- Utilizzando un pennello da artista, depositare immediatamente il microprelievo di tessuto in una provetta stabile a -80 °C mantenuta su ghiaccio secco. Il tessuto dovrebbe aderire facilmente alla parete della provetta. Riporre nuovamente la provetta contenente il microcampione sul ghiaccio secco.
- Ripetere i passaggi 3.2 - 3.4 per ciascuna regione cerebrale di interesse.
4. Archiviazione del tessuto
- Al termine della microdissezione, utilizzare il sistema scanner VisionMate per registrare i codici a barre corrispondenti a ciascun tubo TrakMates contenente campioni. Una volta riempito il rack per tubi TrakMates da 96 posizioni, scansionare rapidamente il rack e inserire immediatamente i campioni di tessuto in un congelatore a -80 °C fino all'estrazione dell'RNA.
5. Estrazione di RNA totale
- Preparare un'area di lavoro priva di RNasi utilizzando RNaseZap. Preparare una quantità sufficiente di miscela di perle magnetiche e soluzione di lisi/legame come descritto nel protocollo MagMAX-96 per l'isolamento totale di RNA10.
- Rimuovere i campioni di tessuto dal congelatore a -80 °C e posizionare immediatamente i tubi su ghiaccio secco.
- Aggiungere 100 μL di soluzione di lisi/legame a un tubo TrakMates contenente il campione. Applicare un pestello di dimensioni adatte a un tubo da 0,5 ml privo di nucleasi al miscelatore di pellet e omogeneizzare il tessuto. Trasferire, utilizzando una punta di pipetta priva di nucleasi a bassa ritenzione, il campione omogeneizzato in una pozzetta di una piastra per colture cellulari rotonda a 96 pozzette. Aggiungere immediatamente 60 μL di isopropanolo al 100% al campione mediante una punta di pipetta priva di nucleasi a bassa ritenzione e mescolare aspirando e dispensando 3-4 volte.
- Aggiungere 20 μL della miscela di perle al campione utilizzando una punta di pipetta priva di nucleasi a bassa ritenzione. Mescolare aspirando e dispensando 3-4 volte.
- Ripetere i passaggi 5.3-5.4 per tutti i campioni di tessuto.
- Seguire i passaggi del protocollo MagMAX-96 per l'isolamento totale di RNA a partire dal punto III.A.2 per completare l'estrazione totale di RNA. NOTA: Sono disponibili in commercio altri kit per l'isolamento totale di RNA basati su perle magnetiche; tuttavia, non sono stati esaminati nel presente studio. Si prega di consultare i manuali dei produttori per i dettagli relativi all'isolamento totale di RNA con i rispettivi prodotti.
- Misurare la purezza e la concentrazione dell'RNA totale ottenuto mediante uno spettrofotometro NanoDrop 3300 o altre tecnologie spettrofotometriche/fluorimetriche per volumi ridotti.
6. Risultati rappresentativi:
| Regione/Centro cerebrale | Diametro del campionatore tissutale (mm) | RNA totale (ng/μL) | Rapporto 260/280 |
| Corteccia frontale | 2,0 | 27,03 | 1,99 |
| Nucleo accumbens | 1,0 | 6,26 | 2,77 |
| Striato | 1,5 | 27,94 | 2,19 |
| Corteccia cingolata | 1,5 | 29,05 | 2,07 |
| Ipotalamo - Nucleo paraventricolare / Nucleo sopraottico (PVN/SCN) | 2,0 | 40,34 | 2,03 |
| Talamo | 2,0 | 34,40 | 2,00 |
| Ipotalamo - Nucleo dorsomediale / Nucleo ventromediale (DMH/VMH) | 2,0 | 44,83 | 2,05 |
| Amygdala | 1,0 | 10,06 | 1,89 |
| Ipocampo - Ca 2/3 | 1,5 | 7,31 | 2,32 |
| Ipocampo - Ca1/Giro dentato | 1,5 | 5,20 | 2,24 |
| Grigio periacqueduttale | 1,0 | 48,21 | 2,02 |
| Nucleo raphe dorsale | 1,0 | 6,56 | 2,18 |
| Formazione reticolare | 2,0 | 35,35 | 2,27 |
Tabella 1. Enumerazione delle regioni cerebrali di topo microdissezionate con i rispettivi diametri ottimali del corer per tessuti, resa totale rappresentativa di RNA e purezza. Le 13 regioni cerebrali microdissezionate, elencate in ordine rostro-caudale, variano per dimensione e orientamento. Il prelievo micropunzonato dell'PVN/SCN comprende il nucleo paraventricolare anteromediale, porzioni del nucleo periventricolare, la zona subparaventricolare e altri neuroni parvocellulari. Il prelievo micropunzonato del talamo comprende nuclei talamici anteriori situati nello stesso piano coronale della regione del prelievo micropunzonato PVN/SCN. Il prelievo micropunzonato DMH/VMH comprende nuclei magnocellulari accessori e altri neuroni parvocellulari situati tra il nucleo dorsomediale e il nucleo ventromediale. Il campione dell'amigdala include sia le sottoregioni centrale che basolaterale. La resa di RNA e i rapporti 260/280 sono valori singoli ottenuti da rispettivi campioni di microdissezione per dimostrare i valori rilevati per ciascuna regione cerebrale.
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Discussione
In questo protocollo esistono molti passaggi critici che richiedono un'attenta considerazione e attenzione. La scelta del diametro appropriato del corer per tessuti deve essere determinata in base alla rimozione di ciascuna specifica regione di interesse. Sebbene i diametri del corer per tessuti riportati nella Tabella 1 siano adatti al prelievo delle regioni cerebrali elencate, ogni ricercatore dovrebbe stabilire le dimensioni ottimali del corer per un prelievo efficiente del proprio tessuto (o dei propri tessuti) di in...
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarato.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato dalla Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) e dall'Army Research Office (ARO), numero del contributo W911NF-10-1-006.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Bagno termostatato Isotemp 102 | Fisher Scientific | 15-460-3Q | |
| RNase Zap | Ambion | AM9782 | |
| Agitatore orbitale da laboratorio | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 2314 –- 1CEQ | |
| Miscelatore per pellet | VWR international | 47747-370 | |
| Pestello da 0,5 mL privo di RNasi | VWR international | KT749521-0590 | Privato di nucleasi |
| Diethyl pyrocarbonato (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758-50ML | |
| Lame di rasoio a doppio taglio | Stoelting Co. | 51427 | |
| St–Affettatrice per tessuti con micrometro manuale | Stoelting Co. | 51425 | |
| Artista 2/0 tondo’spazzola s | Princeton Art Brush | 4350R | |
| Harris Uni-Core, corer per tessuti (0,75 mm) | Ted Pella, Inc. | 15072 | |
| Harris Uni-Core, corer per tessuti (1,0 mm) | Ted Pella, Inc. | 15099 | |
| Harris Uni-Core, corer per tessuti (1,5 mm) | Ted Pella, Inc. | 15075 | |
| Harris Uni-Core, corer per tessuti (2,0 mm) | Ted Pella, Inc. | 15076 | |
| Ghigliottina | Braintree Scientific, Inc. | RG-100 | |
| DecapiConi | Braintree Scientific, Inc. | MDC-200 | |
| HyClone Earle’una soluzione equilibrata di sali (EBSS) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30029.02 | |
| pipette da 25 mL | Corning | 4489 | Privato di nucleasi |
| epT.I.P.S. Punte per pipetta LoRetention con doppio filtro, 20 — 300 μL | Eppendorf | 0030 077.636 | |
| Tubi con tappo a vite TrakMates | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3741 | |
| Lettore di codici a barre 2D wireless VisionMate | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3122MTX | |
| Lettore di codici a barre 2D VisionMate SR con singolo alloggiamento | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3115 | |
| 1-200 μPunte per pipetta universali | Corning | 4864 | Privato di nucleasi |
| Piatti per coltura cellulare Cellstar | Greiner Bio-One | 628160 | Privato di nucleasi |
| Piastra da coltura cellulare Greiner Bio-One in polistirene, 96 pozzetti, fondo rotondo | USA Scientific, Inc. | 5665-0180 | Privato di nucleasi |
| #4 Carta da filtro | Whatman, GE Healthcare | 1004 150 | |
| Pompetta per pipette di sicurezza a bulbo in silicone | Fisher Scientific | 13-681-102A | |
| NanoDrop 3300 Spettrofotometro | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ND-3300 |
Riferimenti
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- Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq. J. Biomed. Biotechnol. 853916, (2010).
- Nagalakshmi, U., Waern, K., Snyder, M. RNA-Seq: a method for comprehensive transcriptome analysis. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 4, 11-13 (2010).
- Anglicheau, D., Muthukumar, T., Suthanthiran, M. MicroRNAs: small RNAs with big effects. Transplantation. 90, 105-112 (2010).
- Forrest, A. R., Carninci, P. Whole genome transcriptome analysis. RNA. Biol. 6, 107-112 (2009).
- Twine, N. A., Janitz, K., Wilkins, M. R., Janitz, M. Whole transcriptome sequencing reveals gene expression and splicing differences in brain regions affected by Alzheimer's disease. PLoS One. 6, e16266-e16266 (2011).
- Paulsen, S. J. Gene expression profiling of individual hypothalamic nuclei from single animals using laser capture microdissection and microarrays. J. Neurosci. Methods. 177, 87-93 (2009).
- Winrow, C. J. Refined anatomical isolation of functional sleep circuits exhibits distinctive regional and circadian gene transcriptional profiles. Brain. Res. 1271, 1-17 (2009).
- Atkins, N. Circadian integration of glutamatergic signals by little SAAS in novel suprachiasmatic circuits. PLoS One. 5, e12612-e12612 (2010).
- Technologies, L. MagMAX-96 Total RNA Isolation Kit Instruction Manual. , Forthcoming.
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Ristampe e permessi
