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Summary

Qui, descriviamo dettagliati vivere metodi di imaging per lo studio delle cellule chemiotassi. Vi presentiamo fluorescenza metodi microscopici di monitorare le dinamiche spazio-temporali di segnalazione eventi nella migrazione delle cellule. Misurazione di eventi di segnalazione ci permette di capire meglio come un GPCR di segnalazione rete raggiunge gradiente di rilevamento di fattori chemiotattici e controlli migratori direzionale delle cellule eucariotiche.

Abstract

Molte cellule eucariotiche in grado di rilevare gradienti di segnali chimici nei loro ambienti e di conseguenza migrano ^1. Questa migrazione delle cellule guidata è denominato come chemiotassi, che è essenziale per varie cellule di svolgere le loro funzioni come il traffico delle cellule immunitarie ed il modello di cellule neuronali ^{2, 3.} Una grande famiglia di proteine ​​G recettori accoppiati (GPCR) rileva variabile piccoli peptidi, noto come chemochine, per dirigere la migrazione delle cellule in vivo ^4. L'obiettivo finale della chemiotassi ricerca è quello di capire come un macchinario sensi GPCR chemochine gradienti ei controlli di segnalazione eventi che portano alla chemiotassi. A tal fine, usiamo tecniche di imaging per monitorare, in tempo reale, le concentrazioni di fattori chemiotattici spazio-temporale, il movimento delle cellule in un gradiente di chemiotattico, GPCR mediata eterotrimerica attivazione di proteine ​​G, e gli eventi di segnalazione intracellulare coinvolte nella chemiotassi di cellule eucariotiche ^5-8 . L'organismo semplice eucariotiche, Dictyostelium discoideum, display chemotaxic comportamenti che sono simili a quelli dei leucociti, e D. discoideum è un modello di sistema chiave per lo studio chemiotassi degli eucarioti. Come amebe a vita libera, D. discoideum cellule si dividono in media ricchi. Al momento la fame, le cellule entrare in un programma di sviluppo in cui si aggregano attraverso cAMP-mediata chemiotassi per formare strutture multicullular. Molti componenti coinvolte nella chemiotassi di cAMP sono stati identificati in D. discoideum. Il legame di cAMP ad un GPCR (car1) induce la dissociazione di eterotrimeriche G-proteine ​​in Gγ e subunità Gβγ ^{7, 9, 10.} Subunità Gβγ attivare Ras, che a sua volta attiva PI3K, la conversione PIP ₂ nel PIP ₃ sulla membrana cellulare ^11-13. PIP ₃ fungono da siti di legame per le proteine ​​con omologia Pleckstrin (PH) domini, in modo da reclutare queste proteine ​​alla membrana ^{14, 15.} Attivazione dei recettori car1 controlla anche le associazioni membrana di PTEN, che defosforila PIP PIP ₃ a ₂ ^{16, 17.} I meccanismi molecolari sono evolutivamente conservati in chemochine GPCR-mediata chemiotassi di cellule umane come i neutrofili ^18. Vi presentiamo i seguenti metodi per lo studio della chemiotassi D. discoideum cellule. 1. Preparazione delle cellule componente chemiotattici. 2. Imaging chemiotassi di cellule in un gradiente di cAMP. 3. Monitoraggio di una attivazione indotta GPCR di eterotrimeriche G-proteina in cellule vive sola. 4. Imaging chemoattractant-triggered PIP dinamico ₃ risposte a singole cellule vive in tempo reale. I nostri metodi di imaging sviluppato può essere applicato per studiare chemiotassi dei leucociti umani.

Protocol

1. Preparazione delle cellule competenti chemiotattici di Dictyostelium discoideum

1. Per generare cellule di D. discoideum che sono chemiotattica al campo chemoattractant, le cellule crescono in vendemmia rich media D3-T da una cultura agitazione a 22 ° C.
2. Lavare le cellule due volte in non-nutrienti sviluppo tampone (buffer DB contenente 5 mM Na ₂ HPO _4, 5 mM KH ₂ PO _4, 2 mM MgCl _2, e 0,1 mM CaCl _2).
3. Risospendere le cellule nel buffer DB ad una densità di 2×10 ⁷ cellule / ml.
4. Agitare 10 cellule ml in un pallone da 250 ml a 100 rpm a 22 ° C per un'ora.
5. Consegnare 100 l di 7,5 mM magazzino cAMP al 10 celle ml ogni sei minuti più di 6 ore per raggiungere una concentrazione finale di 75 nM cAMP, un processo designato come trattamento cAMP pulsante. Dopo 5-6 ore di trattamento cAMP pulsante, D. cellule discoideum diventare chemiotattica competente verso gradiente cAMP.
6. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 200 g per 5 minuti e poi risospendere le cellule con un tampone DB contenente 2,5 mM di caffeina, e si agita a 200 giri al minuto a 22 ° C per 20 min a basolate cella a una situazione chemiotattica.

2. Imaging cellule chemotaxing in un gradiente chemiotattico visibile e manipolabile

1. Riporto una micropipetta con appena preparato 30 ml di soluzione 1 mM cAMP e Alexa 594 a 0.1μg/μl nel buffer DB.
2. Collegare il Femtotip al titolare micropipetta e collegare il tubo di un apparato pressione di alimentazione, Eppendorf sistema FemtoJet.
3. Fissare il gruppo micropipetta ad un micromanipolatore (Eppendorf TransferMan NK2) micromanipolatore motorizzato per assicurare una pressione costante al fine di stabilire un gradiente stabile.
4. Montare una sola camera LabTek ben riempito con 6 ml di tampone DB su una lente olio 40X su un microscopio confocale e l'utilizzo luminoso-campo dell'ottica, il centro Femtotip nel campo di vista.
5. Accendere l'alimentazione di pressione e di impostare la pressione di compensazione (Pc) per 70 hPa di stabilire un gradiente del campo / Alexa 594 miscela.
6. Visualizza gradiente cAMP attraverso il monitoraggio della miscela di concentrazione desiderata di cAMP e Alexa 594 fluorescenza con eccitazione con una linea di 543 nm laser.
7. Utilizzare la funzione di auto-posizionamento del micromanipolatore per mettere micropipetta nelle posizioni desiderate e impostarle come posizione 1, posizione 2 e posizione 3 di manipolare il gradiente a cui cellule sono esposti.

3. Immobile sistema a celle nonpolarized facilita eventi di imaging segnale coinvolte nel cAMP gradiente di rilevamento

1. Dopo il trattamento la caffeina, rimuovere una aliquota di cellule e centrifugare a 500g per 3 min.
2. Eliminare la soluzione tampone e diluire le cellule a 5×10 ⁵ cellule / ml con tampone DB fresco contenente 2,5 mM caffeina.
3. Applicare 1 ml di sospensione cellulare in un singolo bene da camera o 0,4 ml di ciascun pozzetto di una ben quattro camera.
4. Consentono alle cellule di aderire per 10 minuti, con attenzione pipetta fuori il buffer per rimuovere le cellule distaccati e sostituirlo con lo stesso volume.
5. Individuare le cellule al microscopio desiderato e iniziare imaging.
6. Per un esperimento progettato per monitorare le dinamiche di componenti di segnalamento nelle cellule esporre ad una pendenza, trattare le cellule con 5,0 mM (concentrazione finale) Latrunculin B per 10 minuti prima degli esperimenti.

4. L'attivazione simultanea di monitoraggio eterotrimeriche G proteine ​​e PIP _{3 Produzione}

1. cAMP pulsare sviluppare cellule co-esprimono GαCFP e YFPGβ (cellule G) e cellule che esprimono PIP ₃ Indicatore PH-GFP (cellule PH) ^7.
2. Mescolare i due tipi di cellule con rapporto 1:1 e piastra in camere di un bene o 4-bene.
3. Creare e salvare l'emissione delle impronte digitali di riferimento della curva CFP, YFP e GFP utilizzando la modalità Stack Lambda acquisizione entro l'intervallo spettrale 464-624 nm con una larghezza di 10 nm.
4. Contemporaneamente l'attivazione delle proteine ​​G immagine nelle cellule G e PIP _{3 Produzione} in cellule PH utilizzando con la stessa modalità di acquisizione Stack Lambda all'interno della gamma spettrale 464-544 nm con incrementi di 10 nm.
5. Applicare la funzione lineare Unmixing del software Zeiss 510META utilizzando salvato CFPand YFP e le impronte digitali di emissioni di calcolare matematicamente il contributo di ciascun fluoroforo nel Stack Lambda per separare il PCP e l'intensità YFP nei singoli canali in G.
6. Con la stessa strategia, applicare la funzione lineare Unmixing usando GFP salvate e le impronte digitali emissione sfondo per calcolare matematicamente intensità GFP in cellule PH.

5. Rappresentante dei risultati:

1. Un sistema eccellente modello di D. discoideum per chemiotassi mediata GPCR. un'ameba sociale, D. discoideum esibisce una chemiotassi colpisce durante il ciclo di vita. Grazie ai vantaggi genetici e biochimici, D. D offre una potente system studiare chemiotassi.
2. Chemiotassi di cellule al campo visibile e manipolabile chemoattract. Qui, prima mostra una metodologia semplice per ottenere una relazione lineare tra la concentrazione di cAMP e l'intensità di un colorante fluorescente Alexa 594 da una serie di diluizioni di 2 cAMP mM mescolati con 10 mg / ml Alexa 594 (Fig. 2A). Successivamente, forniamo un modo semplice per visualizzare la pendenza, inoltre, a stabilire una misura quantitativa delle concentrazioni di cAMP di un gradiente per l'intensità di Alexa 594 (Fig. fig. 2B).
3. Motilità cellulare è staccata con polarizzazione delle cellule e di rilevamento direzionale. Un inibitore di polimerizzazione di actina elimina preesistenti polarità morfologica e impedisce anche il movimento delle cellule, pur mantenendo la capacità delle cellule 'di rilevamento direzionale (Fig. 3A). Occupazione di stimolazione cAMP visibile e manipolabile garantisce l'ingresso, per esempio stimolazioni applicate uniformemente o un gradiente. Questo metodo permette un'analisi quantitativa di cAMP indotta redistribuzione dei principali componenti di segnalazione nel macchinario gradiente di rilevamento. Misurata la dinamica spazio-temporale di queste componenti di segnalazione ci permettono di capire come la rete di segnalazione raggiunge adattamento alle stimolazioni uniforme, mentre la generazione polarizzata risposte biochimiche a gradienti (Fig. 3B).
4. Misure sistemiche di cinetica di chemosensing rete di segnalazione in caso di esposizione ad una pendenza. E 'fondamentale per misurare la dinamica / cinetica di direzionale-sensing componenti di segnalamento per capire come ogni componente contribuisce alla creazione di polarizzazione intracellulare quando le cellule esperienza primo gradiente. Applicazione di imaging cellulare dal vivo con un ritmo alto-risoluzione spaziale, per prima cosa mostrano un bifasico PIP3 produzione di cellule che è esposto ad un gradiente di cAMP costante (Fig. 4A-C). L'applicazione di immagini dal vivo di cellule, abbiamo misurato sistematicamente le dinamiche del direzionale-sensing specifica rete di segnalazione da stimolazione cAMP a PIP3 produzione (Fig. 4D, E).
5. Monitoraggio simultaneo eterotrimeriche attivazione della proteina G e PIP _{3 Produzione} su stimolazione cAMP applicata uniformemente. Förster risonanza trasferimento di energia (abbreviato FRET) fornisce un approccio efficace per il monitoraggio eterotrimeriche attivazione della proteina G (dissociazione) al momento della stimolazione cAMP. Qui, abbiamo descritto un conveniente facile adottare sistemi per la misurazione simultanea di eterotrimeriche attivazione della proteina G e PIP ₃ di produzione attraverso il monitoraggio della FRET cambiamento e traslocazione della membrana del PIP ₃ sonda, PH-GFP in G e cellule PH, rispettivamente (Fig. 5 ). Una stimolazione cAMP applicate uniformemente innesca una persistente attivazione della proteina G, mentre che innesca un transitorio PIP ₃ di produzione.

Figura 1: Un sistema eccellente modello di D. discoideum per chemiotassi mediata GPCR. A. Schema mostra un percorso breve di segnalazione del rilevamento direzionale. B. gradiente cAMP induce la chemiotassi rapida D. discoideum cellule. Cellule esprimono PIP ₃ sonda, PH-GFP (Green). Gradiente (Red) è visualizzato da Alexa 594. Barra di scala = 50 micron.

Figura 2: chemiotassi di cellule al campo visibile e manipolabile chemoattract. A. Il grafico mostra una relazione lineare tra la concentrazione di cAMP e l'intensità di un colorante fluorescente Alexa 594 da una serie di diluizioni di 2 cAMP mM mescolati con 10 mg / ml Alexa 594. B. misura quantitativa della concentrazione di cAMP di un gradiente dalla relazione lineare della concentrazione di cAMP e l'intensità del colorante fluorescente Alexa 594 in A.

Figura 3: motilità cellulare è staccata con polarizzazione delle cellule e di rilevamento direzionale. Immagine A. dimostra che le cellule immobile dal trattamento degli inibitori della polimerizzazione Latrunculin B mantenere la capacità di rilevamento direzionale. Cellule esprimono PIP ₃ sonda, PH-GFP (Green). Gradiente (Red) è visualizzato da Alexa 594. B. cAMP manipolabile stimolazione e immobili sistema a celle permette di affrontare le questioni chiave di rilevamento direzionale. Barra di scala = 10μm.

Figura 4: misure sistemiche di cinetica di chemosensing rete di segnalazione in caso di esposizione ad una pendenza. A. Montage mostra un bifasico PIP _{3 Produzione} (verde) della cellula, che è esposto ad un gradiente di cAMP costante (rosso). B. immagine mostra le regioni di interesse (ROI) per la misura della cinetica di PIP _{3 Produzione} presentato in C. C . Cinetica oPIP f ₃ della produzione nelle cellule esposte a una pendenza costante. D. schema mostra la rete di segnalazione del rilevamento direzionale dalla stimolazione cAMP al PIP ₃ di produzione. La cinetica in caso di esposizione ad una pendenza è presentato nelle linee dello stesso colore solido in E.

Figura 5: monitoraggio simultaneo a più eventi di reti GPCR segnalazione. Schema A. mostra misurazione simultanea di eterotrimeriche attivazione della proteina G e PIP ₃ di produzione attraverso il monitoraggio della FRET cambiamento e traslocazione della membrana di PIP3 sonda, PH-GFP in G e cellule PH, rispettivamente. B. Montaggio di immagini arcobaleno di G e cellule PH mostra che una stimolazione cAMP applicate uniformemente innesca una persistente attivazione della proteina G al cellulare periferico, mentre che innesca un transitorio PIP3 produzione. I punti ora vengono prima (0s) e dopo stimolazione per 4.9s, e 10.2s 20.4s. C. Cinetica di attivazione delle proteine ​​G e PIP3 produzione su una stimolazione cAMP applicata uniformemente.

Discussion

I processi di raggiungere chemiotattici stadio competente delle cellule

Per il tipo selvaggio D. cellule discoideum, ci vogliono circa 5 ~ 6 ore pulsare lo sviluppo a temperatura ambiente per indurli in un pozzo-chemiotattica fase competenti durante il quale le cellule visualizzare una morfologia ben polarizzata cellulare e la migrazione cellulare rapida (Fig. 1). Diversi fattori, quali la concentrazione di cAMP per pulsare, la temperatura e diversi background genetico, possono influire sul processo di raggiungere chemiotattici fase competenti. Una guida cAMP gradiente le cellule di muoversi verso la fonte di cAMP, una migrazione cellulare diretto designato come chemiotassi. Tuttavia, le cellule che non hanno raggiunto lo stadio chemiotattica competente a causa di insufficiente sviluppo o il loro background genetico non può mostrare due caratteristiche tipiche: morfologia polarizzata e movimento cellulare rapida. D'altra parte, le cellule che hanno superato la fase chemiotattica competente a causa di un eccesso di sviluppo spesso formano aggregati di cellule, che sono molto difficili da separare in singole celle per gli esperimenti di imaging ..

1. Imaging cellule chemotaxing in un gradiente chemiotattico visibile e manipolabile

Si tratta di un progresso tecnico ai fini fluorescente e manipolabile stimolo chemiotattico in un sistema sperimentale. Storicamente, abbiamo applicato sia applicata la stimolazione omogeneo (chiamato anche la stimolazione uniforme) o stimolazione gradiente di osservare la morfologia cellulare e comportamenti. Tuttavia, una stimolazione "alla cieca" non mostra tempo-spaziale le informazioni su come gli stimoli raggiunge le cellule, quindi getta dubbi su eventuali "anomalie" osservazioni delle risposte delle cellule. Qui si mostra un'applicazione del colorante fluorescente (Alexa594, sonda molecolare) con fattore chemiotattico per stabilire una relazione lineare tra la concentrazione di fattore chemiotattico e l'intensità della monitorati giorno e fluorescenti (Fig. 2A, B). Una combinazione acquisizione di proteina fluorescente verde (GFP) e una emissione di fluorescenza rossa colorante (Alexa594) che ci permette di monitorare sia una stimolazione delle cellule e le risposte su questa stimolazione (Fig. 2C).

Secondo il requisito sperimentale, ci sono più combinazioni disponibili. Pur considerando un nuovo colorante fluorescente, è fondamentale per confermare la fluorescenza è adatta per l'esperimento, soprattutto per un esperimento di pendenza, è importante per confermare la diffusione di co-efficienza dei vostri stimoli e colorante fluorescente. Inoltre, al fine di ottenere una relazione lineare della concentrazione di stimoli e intensità del colorante fluorescente misti, è necessario acquisire la massima concentrazione di stimoli senza saturazione di intensità.

2. Immobile sistema a celle nonpolarized facilita immagini dal vivo di cellule

Chemiotassi è un processo complicato cellulare, tuttavia, può essere sezionato in tre aspetti fondamentali: la polarizzazione cellulare, motilità e di rilevamento direzionale. Morfologicamente, la polarizzazione della a è riferito ad un fronte ben definito che porta e alla fine uscita di una cella. Molti componenti di segnalazione coinvolte nella chemiotassi localizzare sia nel fornt o la schiena in una cellule polarizzate. Direzionale di rilevamento è la capacità di una cellula di tradurre un gradiente extracellulare in una polarizzata polarizzazione biochimica intracellulare. Come mostrato in fig. 3A, il trattamento delle cellule con inibitori della polimerizzazione (Latrunculin B) elimina rapidamente la motilità cellulare e la sua polarizzazione originale. Sorprendentemente, le cellule sono ancora in grado di stabilire una polarizzazione intracellulari, come un accumulo di PIP ₃ nella parte anteriore delle cellule di fronte al gradiente (mostrato come una mezzaluna dalla PIP3biosensor, PH-GFP), indicando che rilevamento direzionale delle cellule possono essere disaccoppiato dal polarizzazione delle cellule e la motilità cellulare. Questo non polarizzati sistema cellulare ci permette di determinare la cinetica di segnalazione componenti essenziali per chemosensing senza la complicazione della motilità cellulare e polarizzazione precedente. Pro e contro, il trattamento dei inibitore della polimerizzazione dell'actina abolisce tutte le dinamiche che a carico di actina-citoscheletro.

3. Monitoraggio della rete di segnalazione da parte multi-spettrale imaging cellulare dal vivo

Impegno di cAMP al suo recettore provoca attivazione della proteina G eterotrimerica. Come successivamente, Gβγ dissocia dalla subunità subunità Gα e attiva effettori a valle per indurre le risposte delle cellule, come PIP3 produzione. Progressi tecnici sul tempo-risoluzione spaziale di microscopia a fluorescenza consentono un immagine simultanea di diversi eventi di segnalazione a livello subcellulare in cellule vive. In questa sezione, per prima cosa mostrano una immagine contemporanea di due molecole di segnalazione con gradiente di monitoraggio cAMP (fig. 4A). Successivamente, vi presentiamo l'imaging spettrale di attivazione G e la sua risposta delle cellule a valle della produzione PIP3 (Fig. 4B). Försterrisonanza trasferimento di energia (abbreviato FRET), noto anche come trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza, la risonanza trasferimento di energia (RET) o trasferimento di energia elettronica (EET), è un meccanismo che descrive il trasferimento di energia tra due cromofori. Ci sono tre criteri per la presenza di FRET: sovrapposizione di emissione del donatore e accettore eccitazione, l'orientamento del caso, e la breve distanza (<10 nm). La distanza / orientamento requisito di due molecole facilita FRET essere un modo efficace per rilevare l'interazione proteina-proteina o cambiare intromolecular conformazione di una proteina. Qui, abbiamo usato il comune utilizzato CFP / YFP FRET coppia (Gα-CFP/Gβ-YFP) per monitorare la dissociazione dinamica di proteine ​​G α / βγ subunità in cellule vive. Come disegno intelligente sperimentale che abbiamo descritto è quello di mescolare due diversi tipi di cellule al fine di monitorare contemporaneamente sia l'attivazione delle proteine ​​G e PIP3 produzione quando non è conveniente misurare tutte le dinamiche in una cella.

Materials

D3-T Growth Media	KD Medical
Caffeine	Sigma-Aldrich
Latrunculin B	Molecular Probes, Life Technologies
Alexa 594	Molecular Probes, Life Technologies
cAMP	Sigma-Aldrich
ChronTrol XT programmable timer	ChronTrol Corp
Miniplus 3 peristaltic pump	Gilbson
Platform rotary shaker
FemtoJet microcapillary pressure supply	Eppendorf
Single- and four-well Lab-Tek II coverglass chambers	Nalge Nunc international
LSM 510 META or equivalent fluorescent microscope	Carl Zeiss, Inc.		a 40X 1.3 NA or 60X 1.4 NA oil DIC Plan-Neofluar objective lens
Olympus X81 or equivalent	Olympus Corporation		Requires a 100X 1.47 NA TIRF objective lens