Titolo Incapsulamento cella di goccioline

Protocollo

NIH3T3 cellule preparazione:

Le cellule A. espulsione

1. Trypsinize cellule, poi diluire 1:1 con mezzi di comunicazione cellulare, e il trasferimento da un pallone T75 ad un tubo da 15 ml Falcon
2. Spin le cellule in una pallina da centrifugazione, aspirare il surnatante e lavare le cellule con DPBS
3. Spin le cellule in una pallina di nuovo e aspirare il surnatante
4. Risospendere le cellule in mezzi di comunicazione
5. Determinare la densità delle cellule con emocitometro (~ 200 x 10 ⁴ cellule / ml per T75 fiasco)
6. Cellula soluzione centrifuga, aspirare il surnatante e risospendere in giusta quantità di supporti per la variazione delle concentrazioni di cellule

B. cella di espulsione

1. Cellule vortice prima di utilizzare per l'espulsione
2. Trasferire 200 ul di soluzione di cella in siringa
3. Impostare la modalità appropriata sul generatore di impulsi
   1. Per espellere gocce singole e multiple gocce (treni), insieme al generatore di impulsi "E. BUR" modalità
   2. Per l'espulsione delle gocce continuo, generatore di impulsi impostato in modalità "NORM"
4. Modificare le impostazioni del segnale
   1. Impostare il livello alto e basso livello di tensione di uscita: HIL a 5 V e LOL a 0 V e assicurarsi che il "LIM" LED è acceso
   2. Impostare il segnale come un impulso quadrato
   3. Modificare la quantità di tempo la valvola solenoide è aperta per l'espulsione delle gocce, modificando il valore di "WID" o cambiando duty cycle ("dovere")
   4. Modificare la frequenza di espulsione, modificando il valore di "PER"
   5. Modificare il numero di goccioline espulse in uno scoppio, modificando il valore di "BUR"
5. Cellula soluzione di espulsione su substrato preparato per l'imaging con microscopio

C. colorazione

1. Portare soluzione colorante con 0,5 microlitri calceina-AM e 2 omodimero microlitri di etidio per ml di DPBS
2. Immergere substrato preparato in soluzione colorante
3. Lasciare campione ad incubare per 10 minuti a 37 ° C prima di imaging

Esperimento di convalida

1. Su una Nikon Eclipse TE-2000 Microscopio U fluorescente
   1. Spot software avanzato (Diagnostics, Inc.)
   2. Live / Dead Assay

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Microscopio a fluorescenza		Nikon Instruments	Eclipse TE-2000 U
Eiettore di cellule a valvola solenoide				Frequenza di funzionamento: 1 kHz, 30 psi, 50 nl~0,5 µl. Alimentatore per valvola a 12 V: corrente di pilotaggio 2,5 A
Serbatoio d'aria portatile da 5 galloni		Coleman	Powermate CT5	Aria compressa: 30 psi
Regolatori di pressione		Marsh Bellofram
Generatore di impulsi			HP8112A	Generazione della frequenza di attuazione: 50 MHz
Stadio XYZ		Newmark Systems		Con motore passo-passo: stadio xy con corsa di 6 pollici (NLS4-6-25), stadio z con corsa di 2,5 pollici (NLS4-2.5-25), controllore a 3 assi (NSC-G3), risoluzione 0,1 µm
NIH 3T3	Linea cellulare			fibroblasti
Tripsina				Soluzione allo 0,05%
Mezzo per cellule NIH 3T3
DPBS	Tampone
T75				Flaconi per coltura cellulare
Tubi conici in plastica				15 ml, per coltura cellulare