Microiniezione stereotassica di un vettore virale per la manipolazione genica in uno striato di cucciolo di topo

Abstract

Fonte: Chen, S., et al., Chirurgia stereotassica per la manipolazione genetica nelle cellule striatali del cervello di topo neonatale. J. Vis. Exp. (2018)

Questo video mostra l'iniezione stereotassica di un vettore virale che codifica per la Cre ricombinasi e la proteina a fluorescenza verde o GFP nello striato di un cucciolo di topo geneticamente modificato per ottenere la manipolazione genica asportando una cassetta STOP fiancheggiata da loxP, attivando la proteina a fluorescenza rossa o RFP come reporter.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Microiniezione

1. Preparare l'intervento chirurgico sterile strofinando accuratamente lo strumento stereotassico con etanolo al 70%. Immergere lo strumento chirurgico in etanolo al 70% per sterilizzarlo.
2. Strofina la testa del cucciolo con etanolo al 70%. Individua la lambda sul teschio e segna la lambda con un pennarello. Puntare la punta dell'ago verso la lambda e impostare le coordinate antero-posteriore (AP) e mediale-laterale (ML) su zero.
3. Spostare il braccio di iniezione nel sito target in base alle coordinate X e Y del sito target. Per lo striato del giorno postnatale (P) 2 cuccioli, le coordinate sono: AP, +2,4 mm anteriormente alla lambda; ML, ±1,0 mm lateralmente dalla linea mediana; dorso-ventrale (DV), a −1,7 mm dal cranio. Segnare la posizione del colorante verde veloce nel tubo PE10 con una penna.
4. Abbassare lentamente l'ago per iniezione 30G per penetrare attraverso la pelle e il cranio, quindi sollevare la punta dell'ago fino a quando non si ferma sulla superficie del cranio. Impostare la coordinata DV su zero.
5. Abbassare lentamente l'ago per iniezione 30G fino a raggiungere la coordinata DV del sito target. Attendere 1 minuto per consentire al parenchima di riprendere la sua forma normale. Quindi, eseguire il programma di microiniezione (100 nL/min).
6. Assicurati che il segno del colorante verde veloce si muova nel tubo di PE per garantire che il liquido virale venga iniettato nel cervello.
7. Attendere 1 minuto dopo la fine della microiniezione, quindi sollevare lentamente e progressivamente l'ago fino a 1/2 dell'altezza della profondità DV entro 30 s. Dopo 30 s, ritirare lentamente l'ago dalla testa del cucciolo.

2. Recupero post-chirurgico del cucciolo

1. Riscaldare il cucciolo per 20 minuti in un'incubatrice a 33 °C. Controllare il recupero del cucciolo dall'anestesia per ipotermia ogni 5 minuti fino a quando il cucciolo non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la decubito sternale.
2. Riporta il cucciolo alla diga dopo che il cucciolo si è completamente ripreso.

Materiali