Inibizione dell'attività neuronale e sua rilevazione mediante elettrofisiologia in un ratto

Abstract

Fonte: Lai, J., et al. Registrazione elettrofisiologica simultanea e microiniezioni di agenti inibitori nel cervello dei roditori. J. Vis. Exp. (2015)

Questo video mostra una tecnica basata su microiniezione per la registrazione e l'inibizione neuronale simultanea nel collicolo superiore del ratto. La procedura prevede il targeting stereotassico, la perforazione del cranio e l'inserimento di un iniettore, che rilascia un neurotrasmettitore inibitorio durante la registrazione dell'attività neuronale. La stimolazione luminosa evoca potenziali d'azione, mentre la microiniezione di farmaci sopprime l'eccitabilità neuronale. Quando i livelli di neurotrasmettitori diminuiscono, l'attività neuronale ritorna al basale, consentendo lo studio sia dell'inibizione che del recupero.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Montaggio della pipetta per iniezione di registrazione

1. Estrarre un capillare di vetro lungo circa 7 cm (diametro esterno di 1 mm) utilizzando un estrattore per pipette.
2. Rompere la punta del capillare e controllare l'apertura al microscopio ottico. Verificare che il diametro interno sia compreso tra 30 μm e 40 μm.
3. Inserire un filo d'argento lungo 7 cm nel capillare di vetro, con circa 1 cm che sporge dall'estremità non affusolata della pipetta di vetro.
4. Piegare il filamento in eccesso ortogonalmente al capillare di vetro.
5. Applicare una goccia di adesivo plastico flessibile sullo stelo di un ago ipodermico da 30 G.
6. Inserire un ago ipodermico da 30 G nella pipetta di vetro secondo gli schemi presentati nella Figura 1.
7. Aggiungere un secondo strato di colla per garantire una corretta tenuta dalla giunzione tra la pipetta di vetro e l'ago ipodermico.
8. Lasciare asciugare la pipetta con la punta rivolta verso l'alto per circa 12 ore per garantire un corretto indurimento della colla. Il risultato finale è mostrato nella Figura 2.

NOTA: Questa procedura viene eseguita su esperimenti acuti e non è richiesta la sterilizzazione del puntale della pipetta.

2. Preparazione

1. dell'animale Metti il ratto in una scatola per anestesia.
2. Indurre l'anestesia utilizzando isoflurano al 4% per 5-10 minuti.
3. Posizionare l'animale su un tavolo stereotassico con un termoforo e una sonda rettale per mantenere una temperatura corporea di 37 °C. Utilizzare un cono nasale per mantenere l'anestesia con isoflurano al 2%. Fissa la testa del topo usando le barre auricolari e un supporto per i denti.
4. Applicare un unguento oftalmico o un collirio, che includono gocce di atropina all'1% per favorire la dilatazione della pupilla. Per prevenire la secchezza, applicare gocce lubrificanti ogni 30 minuti circa.
5. Radere la testa e pulirla con il 10% di iodio povidone.
6. Per l'anestesia locale, iniettare 0,5 ml di lidocaina al 2% sotto il cuoio capelluto in 2-3 punti sollevando la pelle e inserendo la punta dell'ago.
7. Confermare un livello adeguato di anestesia eseguendo un pizzicamento delle dita dei piedi e osservando la mancanza di movimento. Inoltre, monitorare la frequenza cardiaca per assicurarsi che rientri nei valori normali (da 300 a 400 battiti/min).
8. Incidere il cuoio capelluto in linea retta lungo la mediana con una lama di bisturi #10 per esporre sia le suture coronali che sagittali.
9. Rivela i punti Lambda e Bregma spingendo da parte il tessuto che copre il cranio con una spatola chirurgica.
10. Livellare il cranio in modo che le posizioni Bregma e Lambda siano sullo stesso piano.
11. Per impostare il punto di riferimento, utilizzare un dispositivo stereotassico con un tubo di vetro montato per posizionarlo proprio sopra Bregma. Questo sarà lo "zero" per le coordinate delle misure antero-posteriore e mediale-laterale.
12. Imposta il punto di interesse spostando la montatura stereotassica alle coordinate richieste, annota le coordinate stereotassiche e disegna un quadrato attorno all'area di destinazione che segna il punto in cui verrà eseguita la craniotomia.
13. Utilizzare un trapano chirurgico con una punta sterilizzata lungo il quadrato contrassegnato lentamente senza pressione per rimuovere lentamente il materiale osseo. Fai attenzione a non perforare troppo a lungo nella stessa area, poiché produrrà calore e causerà lesioni sulla corteccia.
14. Quando l'osso che delimita la craniotomia diventa sufficientemente sottile, rimuovere con cura la sezione cranica con una pinzetta per esporre la corteccia.
15. Irrigare frequentemente la corteccia esposta con liquido cerebrospinale artificiale per prevenire l'essiccazione dei tessuti.
    NOTA: La rimozione della dura madre non è necessaria sul ratto poiché la punta dell'iniettore è abbastanza robusta da penetrare.

3. Riempimento e montaggio del sistema di iniezione

1. Riempire la microsiringa da 5-10 μl mediante aspirazione con olio minerale.
2. Riempire l'ago ipodermico con la pipetta di vetro fissa con una soluzione di Chicago Sky Blue (CSB) allo 0,5% e acido γ-aminobutirrico (GABA) 300 μM o una soluzione di lidocaina al 2% con CSB allo 0,5%. Diluire tutte le soluzioni con soluzione fisiologica.
   1. Nel caso di una sostanza abbondante, riempi usando una siringa normale e usa le solite tecniche precauzionali per evitare la formazione di bolle d'aria.
   2. Nel caso di sostanze più costose, utilizzare olio minerale per riempire l'iniettore e l'agente chimico può quindi essere introdotto per aspirazione. Poiché la differenza di densità tra l'olio minerale e l'acqua è relativamente alta, questa sostanza è un buon candidato per l'iniezione di soluzioni acquose.
      NOTA: È possibile aggiungere un colorante per confermare la separazione tra due liquidi.
3. Per riempire la pipetta per iniezione, riempire una siringa da 1 ml con la soluzione per aspirazione e quindi iniettare lentamente la soluzione nella pipetta per iniezione.
4. Prestare particolare attenzione alle perdite nelle regioni indicate nella Figura 1 tamponando queste aree e osservando le perdite iniettando ulteriormente la soluzione lentamente con la siringa.
5. Rimuovere la siringa da 1 ml. Quando lo fai, assicurati di mantenere una leggera pressione sullo stantuffo in modo che il vuoto non rimuova la soluzione dalla pipetta per iniezione.
6. Riempire la microsiringa con olio minerale mediante aspirazione e fissarla saldamente alla pipetta per iniezione riempita, quindi rimuovere accuratamente la soluzione in eccesso dall'iniettore assemblato con una garza.
7. Verificare che il puntale non sia ostruito iniettando un volume molto piccolo, sufficiente a vedere formarsi una piccola goccia sulla punta della pipetta di vetro.
8. Montare l'iniettore sul sistema di micropompa e assicurarsi che sia ben fissato.
9. Posizionare con cautela la punta dell'iniettore alle coordinate target e abbassare la punta sulla superficie della corteccia.
10. Abbassare lentamente l'iniettore utilizzando l'apparato stereotassico fino alla struttura bersaglio (in questo caso collicolo superiore) utilizzando le coordinate anatomiche appropriate.
11. Copri la corteccia esposta con agar caldo per prevenire l'essiccazione dei tessuti.

4. Iniezione e inattivazione reversibile

1. Impostare la pompa di microiniezione per iniettare da 400 a 800 nl a 40 nl/min e premere Esegui per avviare l'iniezione. Si noti che la frequenza dei picchi mostrerà una riduzione durante l'iniezione.
   NOTA: Nella configurazione sperimentale, l'attività neurale si è ripresa entro un'ora dalla fine della somministrazione di GABA. Qualsiasi dispositivo meccanico calibrato può essere utilizzato per applicare pressione sulla siringa per microiniezione al fine di condurre l'iniezione.
2. Dopo l'acquisizione dei dati elettrofisiologici, effettuare l'eutanasia con un metodo approvato dal Comitato Etico Animale locale.

Risultati

Figura 1: Rappresentazione schematica dell'assieme iniettato. Una micro siringa (A) è collegata alla pipetta per iniezione di registrazione, che consiste in un ago ipodermico da 30 G (B) incollato a un filo...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo Nome Azienda Numero di catalogo Commenti Pompa di iniezione (UltraMicroPump III)WPI#UMP3 Console di iniezione (Micro4 Controller)WPI#SYS-MICRO4 Siringa HamiltonHamliton(80301) 701LT 10 μL SYRSiringhe tra 5 e 10 μL utilizzateAdesivo cianoacrilato in gelColla KrazyKG86648RLa forma in gel è più facile da applicare sull'asta dell'ago ipodermico 30GPipette in vetroWPI#TW100F-4Parete sottile, diametro esterno 1 mm, ID 0,75 mm con pipette a filamento utilizzate720 Needle Pipette PullerKopf720 Filo d'argentoA-M Systems, Inc.782500Nudo 0.010"