Consegna del gene subpiale nel midollo spinale del topo per valutare l'espressione genica

Abstract

Fonte: Tadokoro, T., et al. Consegna del vettore del virus adeno-associato subpial 9 (AAV9) in topi adulti. J. Vis. Exp. (2017)

Questo video mostra una tecnica di iniezione subpial per la consegna di geni al midollo spinale nei topi. La procedura prevede l'esposizione della dura madre, la perforazione della pia madre e l'iniezione di un virus adeno-associato ricombinante (rAAV) che trasporta un gene che esprime una proteina fluorescente nello spazio subpiale. Dopo l'iniezione e il recupero, il virus facilita l'espressione genica nelle cellule del midollo spinale, consentendo lo studio dell'espressione genica bersaglio.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Preparazione generale degli animali e della chirurgia

1. Prima di iniziare la procedura chirurgica, scongelare il virus (AAV9-UBI-GFP [UBI: Promotore dell'ubiquitina, GFP: Proteina fluorescente verde]; aliquote da 5 μl). Preparare una soluzione di destrano al 5% (10.000 MW) mescolando la polvere di destrano in acqua distillata. Miscelare la soluzione virale con una soluzione di destrano al 5% 1:1 fino a una concentrazione finale di destrano del 2,5%.
   1. Conserva la soluzione del virus sul ghiaccio (4 °C).
2. Utilizzare topi adulti C57BL/6J (maschio e femmina, 20-30 g). Anestetizzare i topi utilizzando isoflurano al 5% (in O₂, 1 L/min) e mantenerli al 2-3% di isoflurano inalato (in O₂, 1 L/min) per cono nasale durante l'intervento chirurgico, a seconda della frequenza respiratoria e della risposta al pizzico della zampa.
3. Radere la schiena degli animali con un tagliacapelli e pulire la pelle con clorexidina al 2%.
4. Negli studi di recupero cronico, seguire una rigorosa tecnica sterile.
5. Se devono essere eseguite iniezioni subpiali lombari, tagliare la pelle che copre le vertebre Th8-L1 con un bisturi e staccare il muscolo paravertebrale dalle vertebre spinali Th10-12 usando le forbici.
   1. Monta l'animale in una cornice stereotassica standard usando i morsetti spinali del mouse.
   2. Radere entrambi i lati della lamina delle vertebre Th10-12 utilizzando un trapano dentale (punta: 0,9 mm, velocità: 20.000 giri/min) fino a quando non compaiono crepe.
   3. Rimuovere i frammenti ossei incrinati con una pinza ed esporre la superficie dorsale del midollo spinale lombare.
   4. Tagliare la dura madre di circa 1 cm utilizzando un ago in acciaio inossidabile da 30 G e una pinza.

2. Apertura della membrana pial e inserimento dell'ago subpial per l'erogazione AAV9

1. Montare l'ago penetrante pia-penetrante 34 G nel braccio Z di un manipolatore XYZ utilizzando un supporto capillare in vetro (Figura 1A e B).
   NOTA: Per produrre l'ago penetrante pia, la punta smussata originale dell'ago 34G viene affilata utilizzando uno smussatore capillare in vetro con piastra abrasiva diamantata - grossolana (punta da 5,0 μm a 50 μm dimensioni) e angolo di affilatura di 15 - 20°. La punta dell'ago (1 mm di lunghezza, misurata dalla punta) viene quindi piegata delicatamente a circa 90° (Figura 1B, inserto sinistro).
2. Utilizzando un cannocchiale da dissezione chirurgica, impostato su un ingrandimento 8-10X, penetrare la pia con l'ago penetrante nella pia di circa 1 mm (Figura 1C) utilizzando il braccio a X.
   1. Mantieni l'angolo dell'ago penetrante rispetto alla superficie del tessuto a 5-10°.
3. Dopo l'apertura del pia, rimuovere l'ago che penetra orizzontalmente dallo spazio subpiale (Figura 1D) utilizzando il braccio X.
   NOTA: Ricorda il sito penetrato da un punto di riferimento, come un vaso sanguigno.
4. Caricare un ago per iniezione 36G smussato con il virus AAV9-UBI-GFP utilizzando una microsiringa da 50 μL collegata all'ago per iniezione con tubo PE-10 o PE-20.
5. Montare l'ago nel braccio a Z di un secondo manipolatore XYZ (Figura 1A e B) utilizzando un supporto capillare in vetro (Figura 1B, inserto destro).
   NOTA: Per produrre l'ago per iniezione subpial AAV9, la punta smussata di un ago da 36 G viene lucidata utilizzando una smussatrice capillare in vetro con piastra abrasiva diamantata - grossolana (punte da 5,0 μm a 50 μm) per rimuovere gli spigoli vivi. La punta dell'ago (2-3 mm di lunghezza, misurata dalla punta) viene quindi piegata delicatamente a circa 90°. Gli aghi per iniezione pia-penetrante e subpial vengono inseriti in un tubo di acciaio inossidabile 20G slave lungo 1-2 cm (a 10 mm dall'estremità dell'ago) e incollati con resina epossidica. Per un fissaggio sicuro al supporto del capillare in vetro è necessario l'uso di tubi da 20 G (0,91 mm di diametro).
6. Manipolando i bracci X, Y e Z del secondo manipolatore, posizionare la punta dell'ago di iniezione AAV9 nel sito penetrato da pia e quindi farla avanzare di circa 2-3 mm nello spazio subpiale attraverso l'apertura della membrana pial precedente utilizzando il braccio X (Figura 1E e F).
   NOTA: 1) L'AAV9-UBI-GFP è preparato secondo i protocolli precedentemente riportati, e i titoli finali vengono regolati a 1,2 x 10¹³ copie del genoma per mL (gc/mL). 2) Non c'è bisogno di marcare il sito dell'apertura del pial perché è facilmente identificabile (Figura 1D).
7. Iniettare l'AAV9-UBI-GFP (1,5, 3 o 5 μL) nello spazio subpiale utilizzando una microsiringa da 50 μL (vedere la Tabella 1 per i gruppi sperimentali).
8. Rimuovere l'ago per iniezione dallo spazio subpiale, al termine dell'iniezione di AAV9-UBI-GFP.
9. Chiudere il muscolo e la pelle utilizzando la sutura monofilamento 4.0 e le clip chirurgiche.
   NOTA: Non è necessario sigillare la vertebra aperta.
10. Lascia che gli animali si riprendano su un termoforo.
11. Per il controllo del dolore, iniettare Buprenorfina 0,05 mg/kg/sc ogni 12 ore per 2-3 giorni dopo l'intervento.

Tabella 1: Gruppi sperimentali. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti su topi adulti C57BL/6J.

Gruppi sperimentali Sito	/livello di somministrazione di AAV9 (*)	Volume di AAV9 inj, velocità di infusione	Tempo di sopravvivenza	Analisi tissutale
Gruppo A (n = 7)	C2 (bilaterale)	5 μL/5 min	14 giorni	Cervello + midollo spinale
Gruppo B (n = 12)	L1-L2 (bilaterale)	1,5 μL o 3μL, 60 sec/μL	14 giorni	Cervello + midollo spinale
Gruppo C (n = 6)	C2 + L1-L2 (bilaterale ad ogni livello)	5 μL/5 min	14 giorni	Midollo
* - bilaterale = vengono eseguite due iniezioni subpiali, una erogata nello spazio subpiale, destro e una nello spazio subpiale, del/i segmento/i iniettato/i.

spinale

Risultati

Figura 1: Configurazione sperimentale per eseguire iniezioni subpiali spinali in un topo adulto. (A) Per eseguire iniezioni subpiali spinali in topi adulti, vengono utilizzati due manipolatori XYZ separati...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
C57BL/6J Mice	Jackson Labs	664
Lab Standard Stereotaxic for Mice Harvard	Apparatus	72-9568
Mouse Spinal Adaptor	Harvard Apparatus	72-4811
Manipolatore XYZ	Stoelting	51604
Pompa di infusione manuale	Stoelting	51218
34G Ago di nanoriempimento smussato	World Precision Instruments	NF34BV-2
36G Ago di nanofill smussato	World Precision Instruments	NF-36BL-2
Fluriso, Isoflurano	MWI Veterinary Supply	502017
Soluzione di clorexidina	MWI Veterinary Supply	501027
Ago in acciaio inossidabile da 20 G	Becton-Dickinson	305175
Ago in acciaio inossidabile da 23 G	Becton-Dickinson	305145
Ago in acciaio inossidabile da 30 G	in cotone 305128		Becton-Dickinson
	MWI Veterinary Supply	27426
Smussatrice capillare in vetro	Narishige International	SM-25B
Microscopio per vetrini Superfrost	Leica Microsystems	M80
50μl Microsiringa	Hamilton	81242
BD Intramedic PE-20 Tubing	Becton, Dickinson	427406
BD Tubi Intramedic PE-10	Becton, Dickinson	427401
sutura monofilamento 4-0	VetOne	V1D397
Smussatrice capillare in vetro	Narishige	Pipet Micro Grinder EG-40
5 min Epossidica (epossidica trasparente)	Devcon	14310
Dextran	Polysciences, Inc	19411
AAV9-UBC-GFP	UCSD Laboratorio di base per vettori virali

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