Impianto della finestra del midollo spinale in un topo per l'imaging in vivo

Abstract

Fonte: Pietruczyk, E. A., et al. Laminectomia e impianto della finestra del midollo spinale nel topo. J. Vis. Exp. (2019)

Questo video mostra l'impianto di una finestra del midollo spinale in un topo anestetizzato per l'imaging in vivo. Il protocollo stabilizza il midollo spinale esposto utilizzando un vetro di copertura in borosilicato e una piastra posteriore stampata in 3D. Questo metodo consente la microscopia a due fotoni ad alta risoluzione per studiare la dinamica della barriera emato-encefalica e le interazioni neurovascolari.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Impianto del vetro di copertura

1. Applicare delicatamente un vetro di copertura in borosilicato da 3 mm sul cordone esposto.
2. Assicurarsi che l'agarosio si raffreddi a 39 °C. Utilizzando una piccola spatola, applicare il liquido cerebrospinale artificiale caldo al 2% di agarosio/aCSF sul bordo del vetro di copertura e lasciare che l'azione capillare lo attiri sotto la superficie.
   Nota: a temperature inferiori a 39 °C, l'agarosio potrebbe iniziare a gelificare. In tal caso, riscaldare a bagnomaria o nel microonde. Alcuni operatori preferiscono applicare prima una goccia di agarosio e stendere sopra il vetro di copertura.
3. Applicare l'adesivo tissutale sui processi articolari ossei esposti delle vertebre adiacenti intatte a livello toracico 11 della colonna vertebrale vertebrale e del livello toracico 13 della colonna vertebrale. Applicare ulteriore adesivo tissutale in un anello attorno al sito della laminectomia, sopra il tendine adiacente e il processo trasversale.
   Nota: l'adesivo tissutale è necessario per una corretta aderenza al cemento dentale nelle fasi successive. I processi articolari formano una sede naturale su cui la placca posteriore può poggiare stabilmente (Figura 1). L'adesione ai processi articolari formerà i punti di attacco più forti.
4. Mescolare il cemento dentale con l'accelerante in una vaschetta di miscelazione in porcellana. Utilizzare una piccola spatola per trasferire il cemento dentale sullo strato adesivo del tessuto. Utilizzare cemento dentale per far aderire la piastra posteriore al campo chirurgico centrato sopra la finestra. Attendere 10 minuti affinché il cemento dentale indurisca.
   Nota: la solida adesione della piastra posteriore ai processi articolari anteriori e posteriori fornisce la stabilità strutturale fondamentale dell'impianto.
5. Utilizzare ulteriore cemento dentale per riempire la base interna della piastra posteriore e la parte inferiore della piastra posteriore: interfaccia tissutale.
   Nota: l'applicazione extra di cemento dentale migliora l'aderenza e riduce il rischio di fuoriuscita del fluido di immersione dell'obiettivo del microscopio (soluzione fisiologica) dal fondo della piastra posteriore.
6. Avanzare il supporto della piastra posteriore biforcuta nella posizione appropriata sopra la finestra. Fissare la piastra posteriore nel supporto della piastra posteriore con le viti.
   Nota: questo protocollo utilizzava un supporto della piastra posteriore lavorato su misura (Figura 2G\u2012H).
7. Applicare soluzione fisiologica sulla piastra posteriore per verificare la presenza di perdite. In caso di perdite di liquido, asciugare l'area e applicare altro cemento dentale.

2. Preparazione

1. dell'imaging Trasferire l'animale sulla piattaforma chirurgica al tavolo ottico.
   Nota: La nostra piattaforma chirurgica, il supporto della piastra posteriore e il supporto del cono del naso in isoflurano possono essere trasportati tra le stazioni chirurgiche e di imaging a due fotoni come un'unica unità durante l'applicazione dell'anestesia continua con isoflurano (Figura 2D, H). Unità simili possono essere assemblate da forche di supporto, travi e montanti di supporto ottenibili da fonti commerciali (ad esempio, ThorLabs). Per la microscopia intravitale, devono esserci almeno 11 pollici di spazio tra l'obiettivo del microscopio e il tavolo ottico per adattarsi all'altezza della piattaforma chirurgica.
2. Fissare la piattaforma chirurgica al tavolo ottico utilizzando un perno di montaggio in acciaio inossidabile e una forca di serraggio svasata.
3. Applicare soluzione salina fresca nel pozzetto della piastra posteriore. Abbassare una lente ad immersione in acqua nel pozzo.
4. Utilizzare la luce trasmessa o in epifluorescenza per identificare l'area di interesse e di messa a fuoco. Passa alla modalità di scansione laser ed esegui l'imaging in vivo in base alla lunghezza d'onda di eccitazione laser a due fotoni, ai filtri dicroici e passa-banda appropriati per i fluorofori presenti nel tessuto6.

Risultati

Figura 1. Rappresentazione schematica del posizionamento anatomico della finestra del midollo spinale. A) Rappresentazione schematica della vista superiore di un corpo vertebrale toracico inferiore, del processo spinoso e...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastra posteriore ovale stampata in 3D	personalizzata		Campo di imaging stabilizzante
Microscopio chirurgico da dissezione	Leica	M205 C	Dotato di Leica FusionOptics, obiettivo Planapo 0.63x serie M e tavolino scorrevole
Fotocamera per microscopio	Fotocamera a colori Leica	MC170	HD per la visualizzazione del campo chirurgico
Tavolino di scorrimento	Leica	10446301	Il tavolino di scorrimento è costituito da due piastre metalliche. La piastra di base è fissa. La piastra superiore scorre su un'interfaccia ingrassata per consentire il movimento rotatorio e lineare.
Stazione chirurgica e forcella di stabilizzazione	Whale Manufactoring	Laminectomia	personalizzata
Unità di erogazione di isoflurano a basso flusso SomnoSuite	Kent Scientific	SS-01	Somministrazione chirurgica di anestesia con vaporizzatore digitale integrato
Perno di montaggio da 1,5 pollici in acciaio inossidabile	ThorLabs	P50/M	Per il montaggio della stazione chirurgica su tavolo ottico per l'imaging
a due fotoniForca di serraggio svasata per montaggio da 1,5" Post	ThorLabs	PF175	Per stabilizzare la stazione chirurgica montare su tavolo ottico per l'imaging a due fotoni
Microtrapano osseo ideale	Apparecchio Harvard	72-6065	Assottigliamento osseo per laminectomia
Bagno d'acqua	Fisher	Scientific 15-462-10	Soluzione salina riscaldante
Pistola per cauterizzazione	FST	18010-00	Cauterizzazione di piccole emorragie
Termoforo	Benchmark BF11222		Riscaldatore in silicone da 1,9" x 4,5" con conduttori in teflon da 20",
sonda rettale termoaccoppiata da	Physitemp	RET3	Misurazione della temperatura corporea del mouse
Vaselina	Sigma	8009-03-08	Sonda rettale lubrificante
Regolatore termico regolato in feedback	NA personalizzato		Le alternative disponibili in commercio includono la serie Physitemp TCAT
PVA Lance per occhi chirurgiche	Beaver-visitec international	40400-8	Trimmer elettrico per l'assorbimento del sangue
	Wahl	41590-0438	Lama per rifinitura della pelliccia di topo
, #11	FST	14002-14	Pinze per strumenti chirurgici
, #5	FST	11254-20	Pinze per strumenti chirurgici
, #4	FST	14002-14	Strumento chirurgico
Pinze dentate in titatnium	WPI	555047FT	Strumento chirurgico
Forbici per iride in titanio	WPI	555562S	Strumento chirurgico
Adesivo tissutale Vetbond	3M	084-1469SB	Preparazione della superficie del tessuto per acrilico dentale
Vassoio di miscelazione in ceramica	Jack Richeson	420716	Miscelazione di agenti acrilici dentali con accelerante
Orthojet acrilico dentale	Lang Dental	1520BLK, 1503BLK	Piastra posteriore che aderisce in modo permanente al tessuto
Piccolo vetro di copertura rotondo, spessore #1, 3 mm	Apparecchio Harvard	64-0720	finestra ottica
NaCl	Fisher Scientific	7647-14-5	Per aCSF
KCl	Fisher Scientific	7447-40-7	Per aCSF
Glucosio	Fisher Scientific	50-99-7	Per aCSF
HEPES	Sigma	7365-45-9	Per aCSF
MgCl₂·6H₂O	Fisher Scientific	7791-18-6	Per aCSF
CaCl₂·2H₂O	Fisher Scientific	#################	Per aCSF
Carprofen	Rimadyl	QM01AE91	Analgesia
Acqua batteriostatica	Henry Schein	2587428	Diluente per carprofene
Isoflurano	Henry Schein	11695-6776-2	Anestesia
Soluzione di ringer lattato	Baxter	0338-0117-04	Idratazione per topo
Agarosio Alto EEO	Sigma	A9793	punto gel 34-37 gradi C
Unguento lubrificante oftalmico	Akwa Tears	68788-0697	Prevenire l'essiccazione corneale
MOM Microscopio a due fotoni	Sutter

10 W, 5 V K