Incapsulamento del fattore di crescita nervoso in nanoparticelle che imitano le lipoproteine ad alta densità

Abstract

Fonte: Zhu, J., et. al., Preparazione e caratterizzazione di nuove nanoparticelle che imitano l'HDL per l'incapsulamento del fattore di crescita nervoso. J. Vis. Exp. (2017)

Questo video mostra l'assemblaggio graduale di nanoparticelle che imitano l'HDL caricate con NGF utilizzando l'incapsulamento assistito da protamina e l'autoassemblaggio basato sui lipidi per potenziali applicazioni di somministrazione neurotrofica.

Protocollo

1. Preparazione di nanoparticelle che imitano l'HDL dell'NGF

1. Sciogliere gli eccipienti, fosfatidilcolina (PC), sfingomielina (SM), fosfatidilserina (PS), colesterolo oleato (CO) e D-α-tocoferil polietilenglicole succinato (TPGS), in etanolo per preparare soluzioni madre a 1 mg/mL.
   NOTA: Le soluzioni madre sono state aliquotate e conservate a -20 °C. L'oleato di colesterolo veniva conservato in bottiglie scure. Le soluzioni stock PC, SM, PS e CO sono rimaste stabili fino a 6, 3, 12 e 12 mesi, rispettivamente, a -20 °C. La soluzione TPGS è rimasta stabile per almeno 12 mesi a -20 °C.
2. Mescolare 10 μL di NGF (1 mg/mL in acqua) con 10 μL di protamina USP (1 mg/mL in acqua) in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e lasciarla riposare per 10 minuti a temperatura ambiente per formare il complesso.
   NOTA: Le soluzioni madre di NGF e protamina sono state aliquotate e conservate a -20 °C. Il congelamento e lo scongelamento ripetuti non sono raccomandati per l'stock di NGF.
3. Aggiungere 59 μL di PC, 11 μL di SM, 4 μL di PS, 15 μL di CO e 45 μL di TPGS in una fiala di vetro. Mescolare ed evaporare l'etanolo sotto un leggero flusso di azoto per circa 5 minuti; Tutti gli eccipienti devono formare una pellicola oleosa e sottile sul fondo del flaconcino di vetro.
4. Aggiungere 1 mL di acqua ultrapura (tipo 1) alla fiala e omogeneizzare a 9.500 giri/min (8.600 x g) per 5 minuti a temperatura ambiente per formare le nanoparticelle prototipo (NP).
5. Aggiungere il complesso preparato al punto 1.2 alle NP prototipo e incubare a 37 °C per 30 minuti agitando utilizzando una piccola barra di agitazione nella fiala di vetro.
6. Raffreddare le NP mescolando a temperatura ambiente per altri 30 minuti. Dopo che questo si è raffreddato, aggiungere 106 μL di Apo A-I (1,49 mg/mL) e mescolare a temperatura ambiente per una notte per formare le NP finali che imitano l'HDL dell'NGF.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Recombinant Human Beta-NGF	Creative Biomart	NGF-05H
L-a-Phosphatidylcholine (PC)	Avanti	131601P	95%, Uovo,
Pollo Sfingomielina (SM)	Avanti	860062P	Cervello,
Fosfatidilserina suina (PS)	Avanti	840032P	Cervello,
Colesteril oleato suino (CO)	Sigma	C9253
D-α-Tocoferil polietilenglicole succinato (TPGS)	BASF	9002-96-4	Vitamina E Polietilenglicole Succinato
Protamina solfato	Sigma	P3369	soddisfa le specifiche
dei test USPApolipoproteina A1, plasma umano	Atene Ricerca e Tecnologia	16-16-120101	1mg in 671 μl 10 mM bicarbonato di ammonio, pH 7.4
Omogeneizzatore	Tekmar	T 25-S1
Omogeneizzatore Polytron	Kinematica	PT 1200C