Somministrazione endovenosa di bloccanti del recettore per ridurre l'edema cerebrale in un modello murino

Abstract

Fonte: Zeynalov, E. et. al., L'infusione endovenosa continua è la via di trattamento scelta per il bloccante del recettore dell'arginina-vasopressina Conivaptan nei topi per studiare l'edema cerebrale evocato dall'ictus. J. Vis. Exp. (2016)

Questo video mostra la somministrazione endovenosa di un antagonista del recettore dell'arginina-vasopressina (AVP) in un modello murino. L'occlusione transitoria dell'arteria cerebrale media induce edema cerebrale. Un antagonista del recettore AVP viene somministrato attraverso un catetere nella vena giugulare sinistra, alleviando l'edema.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Induzione dell'ictus In Vivo

1. Pre-rivestire il filamento con resina dentale prima dell'intervento chirurgico.
   1. Tagliare un pezzo di filamento lungo 12 mm da una sutura di nylon 7-0. Mescola 2 parti di resina con 1 parte di indurente, quindi immergi immediatamente la punta del filamento nella miscela per coprire circa 1/3 dell'intera lunghezza. Rimuoverlo rapidamente e verificare che sia ricoperto da uno strato di resina dentale dalla superficie liscia.
   2. Asciugare il filamento all'aria per 2 ore prima dell'uso.
2. Posizionare il topo in una camera di induzione per anestesia (volume 2 L) e impostare il flusso di isoflurano all'1,5% in aria ambiente arricchita al 25% di ossigeno a 2 L/min in entrata nella camera.
3. Lasciare che il topo rimanga nella camera di induzione fino a quando non è completamente anestetizzato, come determinato dalla mancanza di risposta al pizzicamento della coda.
4. Posizionare il mouse sul tavolo operatorio con un pad riscaldato e impostare la concentrazione di isoflurano all'1% per il mantenimento dell'anestesia erogata spontaneamente attraverso il cono del naso.
5. Taglia i capelli sulla parte anteriore e posteriore del collo e spruzza il collo con alcol denaturato. Applicare un unguento oftalmico veterinario su entrambi gli occhi.
6. Per monitorare continuamente la temperatura corporea, utilizzare una sonda di temperatura rettale collegata a un display digitale durante l'intervento.
7. Posizionare il mouse in posizione supina, applicare la soluzione scrub povidone-iodio al 10% per la disinfezione, coprire con un telo sterile, quindi praticare un'incisione sulla linea mediana lungo il collo con una lama di bisturi chirurgico di misura 10.
8. Legare temporaneamente l'arteria carotide comune sinistra (CCA) con una sutura di seta 6.0.
9. Posizionare un'altra cravatta sull'arteria carotide esterna sinistra (ECA).
10. Posizionare una clip microvascolare sull'arteria carotide interna (ICA).
11. Praticare un piccolo foro sull'arteria carotide esterna con le forbici microvascolari. Inserire un filamento costituito da una sutura di nylon 7-0 rivestita di resina dentale nell'apertura dell'ECA e farlo avanzare cefalicamente, rimuovendo la clip, fino a quando non si avverte resistenza (circa 5-7 mm dal punto di biforcazione del CCA).
12. Posizionare una legatura temporanea sull'arteria carotide interna per fissare il filamento in posizione. Fare riferimento allo schema, Figura 1A. Chiudere la pelle con una sutura di seta e infiltrare la ferita sulla parte anteriore del collo con 0,2 ml di bupivacaina allo 0,5%, come al punto 2.6.
13. Lascia che il topo si svegli dall'anestesia e riprenda conoscenza in una camera di recupero per 60 minuti. Non lasciare l'animale incustodito fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la decubito sternale.
14. Testare il mouse per il punteggio del deficit neurologico (NDS) come segue: 0 = funzione motoria normale, 1 = flessione del busto e dell'arto anteriore controlaterale al sollevamento della coda, 2 = circonferenza sul lato controlaterale ma postura normale a riposo, 3 = inclinazione sul lato controlaterale a riposo, 4 = nessuna attività motoria spontanea.
    1. Per il test NDS, solleva il mouse per la coda e posizionalo su una superficie piana per l'osservazione (2-3 min). In alternativa, osserva i topi nella camera di recupero. Escludere dall'esperimento i topi che presentano NDS inferiore a 2 a causa di un'occlusione insufficiente dell'arteria carotide media (MCA).
       NOTA: La tecnica di flussimetria laser Doppler può essere utilizzata per confermare l'occlusione MCA.
15. Anestetizzare nuovamente l'animale dopo 60 minuti di recupero nella camera di induzione come descritto sopra, risterilizzare la precedente incisione cutanea con una soluzione scrub di iodio povidone al 10% e riaprire la ferita chirurgica sulla parte anteriore del collo tagliando e rimuovendo la sutura di seta.
16. Per rimuovere il filamento dall'ECA, eseguire i seguenti passaggi:
    1. Posizionare una clip microvascolare sull'ICA. Slegare la sutura sull'ICA ed estrarre il filamento tenendo aperta la clip.
    2. Chiudere la clip e posizionare una fascetta sull'ECA prossimalmente al taglio.
    3. Rimuovere la clip e la legatura dal CCA per ripristinare il flusso sanguigno al cervello. Fare riferimento allo schema, Figura 1B.

2. Installazione del catetere endovenoso (IV) nella vena giugulare per un trattamento continuo di 48 ore

NOTA: Procedere all'installazione del catetere subito dopo il passaggio 1.16.3 senza svegliare il topo.

1. Utilizzare due diverse dimensioni di tubi flessibili: inserire il tubo interno (0,94 mm di diametro esterno; per contenere il farmaco da infuso) nel tubo esterno (3,18 mm di diametro esterno; per proteggere il tubo interno).
2. Posizionare il mouse in posizione prona, applicare una soluzione scrub allo iodio povidone al 10% per la disinfezione e praticare un'incisione di 1 cm sulla parte posteriore del collo con una lama di bisturi chirurgico di misura 10. Girare il mouse in posizione supina, risterilizzare la parte anteriore del collo con una soluzione scrub allo iodio povidone al 10% e riaprire la ferita chirurgica sulla parte anteriore del collo. Scavare il tubo sotto la pelle dall'incisione praticata sulla parte posteriore fino alla parte anteriore del collo e esternarizzarlo dalla ferita aperta di 1 cm.
3. Rimuovere il tessuto adiposo sottocutaneo dal lato sinistro della parte anteriore del collo a circa 1 cm lateralmente dalla linea mediana. Individua la vena giugulare sinistra, posiziona due lacci lungo la vena a 5 mm di distanza e allunga leggermente la vena. Fai un piccolo foro nella vena giugulare tra i due lacci con le forbici microvascolari; Inserire la punta del tubo interno profonda 5 mm caudalmente (verso il cuore).
4. Fissare il tubo con entrambe le fascette alla vena giugulare. Chiudere la pelle sulla parte anteriore del collo con una sutura di seta 3-0. Fare riferimento allo schema, Figura 1C.
5. Fissare il tubo alla pelle nella parte posteriore del collo con una sutura e collegare il tubo a una pompa per microinfusione endovenosa attraverso una parte girevole. La girella consente il libero movimento dei topi all'interno della gabbia con pieno accesso al cibo e all'acqua.
6. Infiltrare le incisioni cutanee sulla parte anteriore e posteriore del collo con 0,2 ml di bupivacaina allo 0,5% per prevenire il dolore post-operatorio.
   NOTA: A seconda dei protocolli animali specifici dell'istituto, gli animali possono essere trattati con oppioidi, farmaci antinfiammatori non steroidei (FANS) o antibiotici prima e dopo l'intervento. Tuttavia, i trattamenti menzionati possono alterare i risultati dell'esito dell'ictus ischemico.
7. Lasciare che l'animale si risvegli nella camera di recupero, quindi alloggiare l'animale in una gabbia separata fino al punto finale dell'esperimento. Non lasciare l'animale incustodito fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la decubito sternale.
8. Impostare la velocità di infusione per il trattamento endovenoso continuo di 48 ore di conivaptan (0,14 mg/ml in destrosio al 5%) o il veicolo a 1,5 ml/kg/ora e iniziare l'infusione.
   NOTA: La quantità totale di conivaptan infuso per via endovenosa deve essere di circa 0,2 mg/topo/giorno in un volume totale di 1,44 ml.

Risultati

Figura 1: Diagramma del modello sperimentale di ictus, installazione del catetere IV e volume rappresentativo dell'infarto a 48 ore dopo l'ictus. Posizione del filamento (mostrato in blu) pre-rivestito di resina (verde) nell'arteria carot...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Pad riscaldato	K&H Manufacturing Inc	1060
Monitor di temperatura con sonda rettale	Physitemp	7029
Bobina di sutura in seta, 6-0	Surgical Specialties Corporation	SP114
Sutura di seta su ago, 3-0	Ethicon	1684G
Sutura in nylon, 7-0	Ethicon	1696G
Resina dentale polisilossano con indurente	Heraeus Kulzer	65817930
Pompa per microinfusione IV	Kent Scietific	GT0897
Girevole 22GA	Instech	375/22PS
Tubi da laboratorio, 0,94 x 0,51 mm	Dow Corning	508-002
Tubi da laboratorio, 3,18 x 1,98 mm	Dow Corning	508-009