Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Iniezione di fattori di riprogrammazione nel
- cervello Impostazione animale, posizionamento stereotassico e perforazioneNOTA: Questo protocollo si concentra sull'uso di Ascl1, Lmx1a e Nurr1 (ALN) per la riprogrammazione della glia NG2 (Neuron-Glial Antigen 2) negli interneuroni. Nella nostra esperienza, gli interneuroni di un fenotipo simile possono essere ottenuti utilizzando altre combinazioni di fattori
- Sposta il braccio M/L-D/V del telaio stereotassico in posizione (sopra l'animale) e fissalo.
NOTA: Il telaio stereotassico consente la regolazione della siringa lungo l'asse anteriore/posteriore (asse A/P, Y), mediale/laterale (asse M/L, X), e asse dorsale/ventrale (asse D/V, Z). - Muovi la siringa lungo i diversi assi del telaio stereotassico per portare la punta del capillare di vetro appena sopra il bregma (il punto di giunzione in cui si incontrano le diverse placche craniche).
- Assicurarsi che la punta del capillare sia perfettamente diritta su entrambi i piani A/P e M/L. In caso di bregma ambiguo, prendere la media delle suture laterali e della linea mediana.
- Quando la punta del capillare è posizionata correttamente sopra il bregma, reimpostare entrambi i valori M/L e A/P su 0,0 sul contatore di coordinate digitale.
- Per assicurarsi che la testa dell'animale sia in una posizione perfettamente piana, utilizzare il contatore di coordinate digitale per misurare il valore della coordinata D/V quando il braccio A/P si trova a +2,0 e -2,0 (M/L = 0,0), nonché quando il braccio M/L si trova a +2,0 e -2,0 (A/P = 0,0). Regolare di conseguenza l'altezza della barra dentale e delle barre auricolari.
- Spostare la siringa alle coordinate desiderate per l'iniezione di vettori virali nello striato (A/P = +1,0; M/L = -2,0, rispetto a bregma).
- Sollevare leggermente la siringa e, osservando il sito di iniezione attraverso il microscopio, praticare un foro utilizzando un trapano dentale alle coordinate di iniezione. Iniziare a perforare nel sito, lavorando in modo circolare e delicato.
NOTA: Non esercitare troppa pressione verso il basso, poiché la punta del trapano dovrebbe essere abbastanza affilata da passare attraverso l'osso senza ulteriore forza. Evitare perforazioni lunghe e prolungate in quanto ciò crea calore. - Al termine della perforazione, verificare che la dura madre rimanga integra ed esposta per l'iniezione.
- Preparazione per l'installazione della siringa
- Posiziona un pezzo di garza di cotone sull'incisione aperta e sciacqua la siringa con una soluzione salina.
- Dopo il lavaggio, prelevare una bolla d'aria di 1-2 μl, seguita da 1 μl di soluzione contenente i vettori virali, evitando bolle involontarie. Assicurarsi che la soluzione virale possa essere facilmente visualizzata sotto la bolla d'aria, durante l'iniezione.
- Iniezione virale
- Rimuovi la garza di cotone dal sito dell'incisione e abbassa la siringa usando il braccio D/V del telaio stereotassico. Quando ci si avvicina alla superficie del cranio, guardare attentamente attraverso il microscopio e misurare il livello D/V della dura madre: dovrebbe gonfiarsi leggermente sotto una leggera pressione.
- Toccando la dura madre con la punta del capillare, impostare la coordinata D/V su 0,0.
- Abbassare la siringa, progredendo lentamente fino alla profondità desiderata (D/V = -2,7, rispetto alla dura madre). Assicurarsi che la traiettoria sia priva di frammenti ossei, in modo che non si osservi alcuna flessione dell'ago/capillare.
NOTA: Le coordinate presentate si riferiscono a un'iniezione dei fattori di riprogrammazione nello striato di topi NG2-Cre. Possono essere utilizzate le coordinate corrispondenti ad altre regioni del cervello. Testare sempre le coordinate per l'iniezione utilizzando prima un colorante (ad esempio, Trypan Blue), un'iniezione di perline colorate o un vettore virale reporter prima dell'iniezione di fattori di riprogrammazione nel cervello di un nuovo ceppo di topo. Se si inietta il blu di tripano, gli animali devono essere sacrificati immediatamente dopo l'intervento chirurgico e il cervello sezionato. I cervelli freschi possono essere tagliati utilizzando un microtomo, mentre sono congelati, e il sito di iniezione può essere determinato dalla visualizzazione della posizione del colorante nel cervello. Se si testano le coordinate utilizzando perline colorate, è possibile determinare il sito di iniezione su cervelli perfusi e tagliati una settimana dopo l'iniezione. In alternativa, è possibile utilizzare un'iniezione con un vettore virale che trasporta un gene reporter e determinare il sito di iniezione in cervelli tagliati perfusi. - Iniettare 1 μL della soluzione virale a una velocità di 0,4 μL/min. Quando l'intero volume è stato iniettato, attendere un periodo di diffusione di 2 minuti prima del prelievo della siringa.
- Dopo la diffusione, ritrarre lentamente la siringa fino a quando la punta del capillare non è completamente fuori dal cervello.
- Posizionare un pezzo di garza di cotone sulla ferita e sciacquare la siringa con una soluzione salina.
- Spostare il braccio M/L-D/V del telaio stereotassico fuori dall'area di lavoro.
- Chiusura della ferita e procedure post-operatorie
- Sutura accurata dell'incisione utilizzando un filo di sutura.
NOTA: Tutti i fili di sutura utilizzati negli animali iniettati devono essere smaltiti in una tazza/fiala contenente una soluzione detergente antivirale. La stessa soluzione viene utilizzata per pulire tutte le superfici circostanti l'area chirurgica che sono state a contatto con i materiali chirurgici. Tutti gli strumenti chirurgici vengono accuratamente lavati e sterilizzati in autoclave alla fine di ogni giornata di intervento. - Rimuovi l'animale dal telaio stereotassico e posizionalo in una stazione post-operatoria, che include una gabbia pulita e riscaldata, l'accesso a cibo e acqua e dove l'animale rimane fino a quando non è completamente sveglio. Durante questo periodo, monitorare attentamente l'animale fino a quando non viene ripreso conoscenza.
- Non ospitare animali operati con animali non operati fino a quando i primi non si sono completamente ripresi dall'intervento chirurgico.
- Sorvegliare quotidianamente gli animali operati. A seconda delle suture utilizzate, assicurarsi che vengano rimosse se necessario. A tutti gli animali è stato somministrato Bupenorphinum (Temgesic a 1 ml/kg) per via sottocutanea come cura post-operatoria.
NOTA: Se si utilizza la stessa siringa per due giorni consecutivi, sciacquarla con acqua, seguita da etanolo al 70% e acqua di nuovo. Lasciare la siringa piena d'acqua per una notte per consentire la dissoluzione di eventuali residui.