Somministrazione elettroforetica di GABA nel focolaio epilettico di un topo anestetizzato

Abstract

Fonte: Slezia, A. et al. La somministrazione elettroforetica di acido γ-aminobutirrico (GABA) nel focolaio epilettico previene le convulsioni nei topi. J. Vis. Exp. (2019)

Questo video mostra la somministrazione elettroforetica di acido gamma-aminobutirrico (GABA) per inibire l'attività convulsiva in un topo anestetizzato. Delinea le fasi coinvolte nell'impianto della sonda, nella registrazione dell'attività neurale, nell'induzione delle convulsioni e nella somministrazione controllata di GABA tramite una pompa ionica microfluidica per valutarne l'efficacia terapeutica.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Chirurgia/Craniotomia

1. Fissare la testa di un topo anestetizzato in un telaio stereotassico. Utilizzando un ago da 30 G, iniettare l'analgesico locale ropivacaina (5 μL, 7,5 mg/mL, vedere la Tabella dei materiali) per via sottocutanea nel sito di incisione pianificato. Attendi 5 minuti affinché abbia effetto.
2. Fai un taglio dritto della linea mediana nella pelle sopra il cranio con un bisturi. Tirare delicatamente la pelle verso i lati con una pinza fine e bloccarla da parte con le pinze serrefine del bulldog per lasciare il cranio esposto per ulteriori lavori.
3. Pulisci il cranio della fascia con un bisturi o qualsiasi strumento simile. In caso di sanguinamento superficiale, rimuovere il sangue con tamponi di cotone o piccoli pezzi di carta assorbente.
4. Prendi una vite di messa a terra rivestita di poli(3,4-etilendioxiofene) polistirene sulfonato (PEDOT:PSS) (dimensione: #00, diametro: 0,047 pollici, lunghezza: 1/8 pollici, vedi Tabella dei materiali) con un filo saldato e collegala con un connettore all'amplificatore headstage.
5. Inumidire il cranio nel punto del foro desiderato e praticare un foro ad alta velocità utilizzando una punta da trapano rotonda e fine (con un diametro di 0,4 mm) sul cranio sopra il cervelletto fino a quando la dura madre non è visibile. Metti la vite di messa a terra nel foro e avvitala con un cacciavite di precisione fino a raggiungere la parte superiore del cervelletto.
   NOTA: La vite a testa è stata rivestita con una soluzione PEDOT:PSS contenente l'1% di 3-glicidilossipropil)trimetossisilano (GOPS) in peso, seguita da cottura a 140 °C per 90 minuti. PEDOT:PSS è un polimero coniugato con una capacità volumetrica nota per essere biocompatibile. GOPS è un reticolante miscelato con PEDOT:PSS per aumentare la stabilità in mezzi acquosi (Figura 1).
6. Con l'aiuto del frame stereotassico, misurare le coordinate stereotassiche per la regione cerebrale desiderata. Ad esempio, la regione di interesse è l'ippocampo, anteroposteriore (AP) -1,8 mm e mediolaterale (ML) a 1,8 mm dal punto di Bregma in base all'atlante cerebrale per topi.
   NOTA: Queste sono le coordinate per l'emisfero destro (Figura 1).
7. Assottigliare un'area del cranio di circa 1-2 mm di diametro sopra la regione target utilizzando un trapano dentale affidabile (vedi Tabella dei materiali) impostato a una velocità elevata fino a quando rimane una membrana ossea sottile, ben levigata e trasparente.
8. Quindi, se lo spessore della membrana ossea è abbastanza sottile (<200 μm), praticare un piccolo foro con una pinza sottile e rimuovere delicatamente lo strato sottile dell'osso. Utilizzare un ago a uncino su misura per rimuovere la dura. Ridurre al minimo le dimensioni della craniotomia e della durotomia per prevenire lo sviluppo di edemi e per ridurre al minimo le pulsazioni cardiache e/o respiratorie del cervello.
   NOTA: La craniotomia deve essere riempita con una goccia di soluzione salina per evitare l'essiccazione e poi riempita regolarmente durante l'esperimento (Figura 1).

2. Inserimento della sonda in silicone multicanale

1. Utilizzare bracci stereotassici con un leggero angolo AP (20°) per la sonda in silicone per lasciare ampio spazio per il posizionamento degli altri due impianti e per avere la registrazione e i siti di iniezione dell'elettrodo, della pompa ionica e della micropipetta il più vicino possibile.
   NOTA: Elettrodi, siringhe e pompe ioniche sono stati ricoperti con una goccia di soluzione di colorante DiI (1,1'-diottadil-3,3,3',3'-tetrametilindobocianina perclorato [DiI]), per la visualizzazione post hoc delle tracce di impianto (0,5 mg/ml DiI in dimetilsolfossido).
2. Posizionare la sonda in silicone sul braccio stereotassico fissato a un supporto magnetico e posizionarla accanto al telaio stereotassico. Impostare l'angolo AP (20°) e quindi collegare la sonda all'headstage e alla vite di messa a terra.
3. Abbassare lentamente la sonda di silicone nell'ippocampo con l'aiuto del braccio stereotassico preciso al micron o di un micromanipolatore motorizzato per evitare movimenti laterali (Figura 1 e Figura 2).
   1. Avvia il software di registrazione e registra - con l'headstage, l'amplificatore collegato e un computer - segnali neuronali elettrici mentre muovi la sonda di silicio multicanale dalla parte superiore della corteccia fino a raggiungere la posizione dorsoventrale (DV) mirata (-1.800 μm dalla superficie corticale). Registra e guarda il segnale di potenziale di campo locale (LFP) durante la penetrazione sullo schermo del computer.
      NOTA: Controlla la discesa della sonda in modo che si muova lentamente e continuamente durante la registrazione, per avere un migliore controllo visivo per la penetrazione e per raggiungere la zona target.
   2. Utilizzare l'attività di ondulazione nello strato piramidale della formazione ippocampale nell'LFP registrato come marcatore della zona target.
      NOTA: L'attività di ondulazione è visibile su uno o due canali adiacenti della sonda multicanale in silicio (Si) con una distanza di 100 μm tra i siti di registrazione (Figura 3).
   3. Registrare simultaneamente i segnali LFP dagli strati della corteccia e dell'ippocampo attraverso il software dell'amplificatore multicanale (vedere la Tabella dei materiali) con l'aiuto delle sonde Si multicanale (Figura 3).

3. Inserimento della pompa ionica microfluidica (μFIP)

1. Collegare i tubi (vedere la tabella dei materiali) all'ingresso del μFIP e riempire la sonda con una soluzione di acido gamma-aminobutirrico (GABA) 0,05 M. Rimuovere i tubi e chiudere l'ingresso con pellicola di paraffina. Collegare i cavi elettrici all'unità di misura della sorgente.
2. Inserire il μFIP con l'aiuto del braccio stereotassico con un angolo mediolaterale (MP) (20°). La sonda Si rimane inserita durante l'intero processo.
   NOTA: μFIP è molto flessibile e può beneficiare del supporto di un pennello piccolo e pulito per mantenerlo dritto fino a raggiungere la superficie del cervello. Dopo questo passaggio, la μFIP può essere abbassata delicatamente con movimenti assiali.
3. Abbassare lentamente il μFIP con movimenti assiali e non lasciarlo mai piegare durante la traiettoria fino a raggiungere la coordinata dorsoventrale (DV) (-1.200 μm dalla superficie corticale).
   NOTA: Cercare di avvicinare il più possibile i due dispositivi (μFIP e sonda al silicio), considerando la distanza di 300 μm dell'uscita dalla punta μFIP.
   ATTENZIONE: Evitare problemi meccanici tra i dispositivi e i loro connettori durante l'inserimento (Figura 1B e Figura 2B).

4. Preparazione dei dispositivi per

1. l'induzione delle crisi Sostituire l'ago metallico della siringa (10 μL) (vedi Tabella dei materiali). Rimuovere la parte metallica che tiene l'ago, posizionare e fissare la micropipetta (diametro esterno [OD]: 1,2 mm, diametro interno [ID]: 0,75 mm, diametro della punta: 20–50 μm con ± 0,5 cm di rastremazione del gambo), quindi sostituire l'elemento porta-ago.
2. Posizionare la siringa e la micropipetta borosilicata collegata con un angolo lateromediale di 20° (LM) per l'iniezione di 4-amminopiridina (4AP) (50 mM nel liquido cerebrospinale artificiale [ACSF]).
   ATTENZIONE: Non utilizzare l'ago metallico della siringa o una micropipetta con una punta più grande di 50 μm.
3. Aspirare 500 nL–1 μL di 50 mM 4AP con l'aiuto di una pompa di microiniezione automatizzata.

5. Inserimento della pipetta di vetro collegata a una siringa per l'iniezione di 4AP

1. Abbassare la micropipetta di vetro collegata alla siringa nella posizione DV desiderata (-1.500 μm), quindi iniettare 250 nL della soluzione 4AP (Figura 1 e Figura 2). Avviare la registrazione con il software di registrazione. Guarda lo schermo e attendi che appaia il primo picco interictale.
2. Inizia immediatamente la somministrazione di GABA per μFIP con la comparsa del primo picco interictale. Erogare GABA applicando 1 V tra la sorgente e il target per 100 s seguito da 1 s di spegnimento per 30 cicli. Con l'aiuto del software di registrazione, registrare per un minimo di 2 h.
   NOTA: La massa totale del GABA erogato è di circa 1 nmol (Figura 4).
3. Al termine dell'esperimento, rimuovere delicatamente le sonde inserite e la vite di messa a terra, e rimuovere l'animale dall'apparecchiatura stereotassica. Gli animali sono stati soppressi utilizzando un'overdose di farmaco (i.p.100mg/kg di pentobarbital). La morte è stata confermata dalla cessazione del respiro e della circolazione.

Risultati

Figura 1: Cranio-durotomia e localizzazione degli impianti nel cervello del topo. (A) Vista schematica dell'intervento chirurgico, della craniotomia e del bersaglio degli impianti nel cervello del topo. (B) Ut...

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