Iniezione virale stereotassica per l'editing genico neuronale mirato nel cervello del topo

Abstract

Fonte: Fricano-Kugler, C. J., et al. Progettazione, confezionamento e consegna di CRISPR retrò e lentivirus ad alto titolo tramite iniezione stereotassica. J. Vis. Exp. (2016)

Questo video mostra l'iniezione virale stereotassica per un preciso editing genico neuronale nel cervello del topo. Il protocollo garantisce un'accurata consegna del virus al giro dentato, consentendo la marcatura fluorescente e il knockout genico mediato da CRISPR per studiare i circuiti neurali, la funzione genica e i meccanismi della malattia in vivo.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Iniezione stereotassica

1. Verificare che la ventilazione della sala operatoria sia aperta per garantire un flusso d'aria adeguato. Preparare il topo per l'intervento chirurgico anestetizzandolo con isoflurano al 4% in una camera di induzione. Dopo l'anestesia, radere la testa per preparare il sito di iniezione.
   1. Posiziona il mouse nello strumento stereotassico usando una pinzetta per spostare la lingua verso il basso e di lato. Inserisci la barra del morso in bocca fino a quando i denti non cadono nella fessura, quindi fissa le barre auricolari. Assicurarsi che il corpo del mouse sia sul termoforo e che il naso sia situato nel cono. Dirigere l'isoflurano al 4% nel cono del naso. Confermare l'anestesia pizzicando il piede con una pinzetta e assicurandosi che non vi siano riflessi di spavento.
   2. Applicare lacrime artificiali per lubrificare gli occhi. Terminare la preparazione del sito di iniezione tamponando la testa rasata con cicli alternati di iodio povidone e lidocaina.
2. Usando un bisturi, taglia una piccola incisione lungo il centro del cuoio capelluto. Asciugare il cranio con un tampone e perossido di idrogeno, se necessario, per aiutare a visualizzare il bregma.
   1. Usando un cannocchiale da dissezione, individua il bregma sul cranio e posiziona la punta del trapano sul bregma. Azzerare (o registrare) le coordinate stereotassiche digitali sui piani x, y e z.
   2. Per garantire che la testa sia a livello dell'asse y rostrale-caudale, posizionare la punta del trapano su lambda e livellare la testa in modo che la coordinata z sia approssimativamente uguale sia a bregma che a lambda.
   3. Per garantire che la testa sia in piano sull'asse x, posizionare la punta del trapano a y = 1/2 lambda. Assicurarsi che la coordinata z sia uguale a 1 mm su ciascun lato (x = +/-1 mm) della sutura sagittale. Regola il teschio se c'è una differenza nella coordinata z a 1 mm a sinistra e a destra di lambda.
3. Posizionare il trapano sulle coordinate desiderate. Per il giro dentato, utilizzare le coordinate y = -1.9 da bregma e x = +/- 1.1. Prima di perforare, abbassare l'isoflurano al 2%, quindi perforare lentamente e con attenzione il cranio.
   1. Dopo aver praticato tutti i fori, applica la siringa piena sullo strumento stereotassico. Centrare visivamente la siringa sul foro e azzerare la coordinata z sul cranio.
   2. Abbassare lentamente la siringa fino alla profondità z più profonda. Per il giro dentato, le profondità z sono -2,5, -2,4 e -2,3. Iniziare l'iniezione a una velocità di 0,25 μl/min utilizzando un iniettore stereotassico.
      1. Dopo che l'iniezione è stata completata alla profondità Z più bassa, attendi 1 minuto, poi passa alla coordinata successiva e ricomincia l'iniezione. Continuare questo schema fino a quando non vengono iniettate tutte le coordinate di iniezione z. Attendere 2 minuti prima di rimuovere la siringa dopo l'ultima iniezione.
         NOTA: Non sono stati osservati effetti avversi sul tessuto iniettando fino a 2 μl di virus per emisfero nel cervello del topo.
   3. Ripetere l'iniezione per altri fori.
4. Dopo l'iniezione, rimuovere il topo dallo strumento stereotassico e suturare il cuoio capelluto con suture di seta 6-0. Applicare lidocaina e una crema antibatterica sulla ferita.
   1. Inietta 0,8-1,0 ml di soluzione salina + Ketoprofene (3-5 mg/kg) per via intraperitoneale (I.P.) per gestire il dolore. Quindi, posizionare il mouse nella camera di recupero riscaldata. Non lasciare l'animale incustodito fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la decubito sternale. Non restituire l'animale alla compagnia di altri animali fino a quando non si è completamente ripreso.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Stereotaxic Chirurgia Reagenti
Vet-Siringa veterinaria uso T.B. Siringa solo 1cc luer slip T.B. 100/bx	Med-Vet International	1CCVLS
Isoflurane
Lame per bisturi in acciaio inossidabile, #10, confezione da 100	Med-Vet International	JOR580S
Unguento lacrimale artificiale	Med-Vet International	RXPARALUBE-O
PVP PrepSolution	Med-Vet International	HPIV108208H
soluzione salina normale	Med-Vet International	DYND500MLSH
Applicatori con punta in cotone	Med-Vet International	CTA6
Unguento antibiotico triplo	Med-Vet International	RXTRIP-OI15
MONOJECT® Aghi Soft Pack 25g x 5/8"	Med-Vet International	25058
6-0 suture di seta	Med-Vet International	MV-711