Somministrazione di farmaci neuroterapeutici basata su pompa osmotica in un modello murino demielinizzato

Abstract

Fonte: Wang, X. et. al., Osmotic Pump-based Drug-delivery for In Vivo Remyelinning Research on the Central Nervous System. J. Vis. Exp. (2021)

Questo video mostra il metodo per la somministrazione di farmaci neuroterapeutici utilizzando una pompa osmotica in un modello murino demielinizzato. Il rilascio controllato del farmaco promuove la rimielinizzazione attivando le cellule produttrici di mielina nel corpo calloso.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Istituzione del modello murino di demielinizzazione indotta da lisocitina Preparare una

1. soluzione di lisolecitina all'1% (chiamata anche L-α-lisofosfatidilcolina) con soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS).
2. Sterilizzare forbici, pinze, emostatici curvi e altri strumenti chirurgici mediante sterilizzazione in autoclave. Sterilizzare l'area chirurgica e stendere i fogli sterili. Tutti i materiali e i reagenti utilizzati per la chirurgia devono essere preparati in modo asettico. È importante mantenere sterile l'area chirurgica durante tutta la procedura.
3. Anestetizzare un topo C57BL6 del giorno postnatale 56 (P56) come segue.
   1. Posiziona il mouse nella camera di isoflurano della macchina per anestesia per piccoli animali. Regolare il flusso di O₂ a 300-500 mL/min e l'isoflurano al 3%-4%. Dopo un'anestesia sufficiente, quando il topo si immobilizza con un respiro lento e stabile, trasferire il mouse nell'apparato stereotassico con un termoforo.
   2. Commutare l'uscita del gas dalla camera alla maschera per anestesia e regolare l'isoflurano all'1%-1,5% per mantenere il mouse nello stato di anestesia. Attendere che il topo sia completamente anestetizzato, quindi iniettare ketoprofene (3-5 mg/kg) per via intraperitoneale per alleviare il dolore. Prima dell'operazione, pizzicare le dita dei piedi del topo e controllarne la reazione per confermare l'avvenuta anestesia.
   3. Quando il topo è anestetizzato, non può regolare la sua temperatura corporea. Pertanto, monitorare e regolare la temperatura corporea del topo durante l'intervento chirurgico. Copri la superficie dei bulbi oculari del topo con un unguento per gli occhi all'eritromicina per mantenere i bulbi oculari umidi durante l'anestesia.
4. Fissare la testa del mouse nell'apparato stereotassico con la barra dei denti e le barre auricolari. (Figura 1A).
5. Usa un rasoio per rimuovere i peli dalla parte superiore della testa. Igienizza la pelle della testa con tre cicli di betadina ed etanolo al 75%. Per motivi etici, coprire il corpo dell'animale ad eccezione del sito dell'intervento. Usando un bisturi, praticare un'incisione medio-sagittale lunga 1 cm della pelle dalla base del collo fino a tra gli occhi per esporre il cranio (Figura 1B).
6. Pulire delicatamente la superficie del cranio con un batuffolo di cotone sterile contenente il 30% di perossido di idrogeno per visualizzare le suture craniche (Figura 1C). Regolare l'altezza della barra dentale e delle barre auricolari per posizionare il punto lambda e il punto bregma alla stessa altezza (cioè con le stesse coordinate dell'asse z quando la punta dell'ago tocca i punti), in modo che la sutura sagittale sia orizzontale.
7. Posizionare delicatamente la punta dell'ago della siringa da microlitro (10 μL, 33 G) nel punto di bregma e reimpostare le coordinate x, y e z su 0 (Figura 1D). Spostare la siringa nel sito di iniezione (x: 1,04; y: 1,0, cioè 1,04 mm lateralmente alla linea mediana e 1,0 mm posteriormente al punto di bregma) secondo le indicazioni della lettura digitale (Figura 1E).
8. Praticare lentamente un piccolo foro di bava attraverso il cranio nel sito di iniezione senza penetrare la dura madre con un ago per siringa da 1 ml (26 G, 0,45 mm) (Figura 1F). Inserire lentamente l'ago della siringa da microlitro nel tessuto cerebrale attraverso il foro fino a raggiungere una certa profondità (z = -1,62 mm per la maggior parte dei topi P56) (Figura 1G).
   NOTA: Empiricamente, la profondità di inserimento di -1,62 mm consente alla punta dell'ago di raggiungere il centro del corpo calloso della maggior parte dei topi P56 in modo che la lisolecitina possa essere erogata direttamente nel corpo calloso per indurre la demielinizzazione.
9. Iniettare 1,5 μl di lisolecitina all'1% a una velocità di 0,3 μl/min. Dopo l'iniezione, attendere 5 minuti prima di estrarre lentamente la siringa da microlitro per evitare perdite di liquido lungo il percorso dell'ago per iniezione.
10. Cucire la pelle con suture chirurgiche 5-0 (Figura 1H).
11. Posizionare il mouse su un termoforo per evitare un calo della temperatura corporea. Somministrare un'iniezione sottocutanea di 5 mg/kg di carprofene ogni 24 ore per alleviare il dolore. Applicare ogni giorno unguento all'eritromicina sull'incisione per assicurarsi che la ferita guarisca correttamente. Metti il topo che ha subito un intervento chirurgico in una gabbia da solo e nutrilo con cibo umido fino a quando non si riprende completamente. Monitorare il mouse quotidianamente dopo l'operazione.

2. Preparazione della pompa osmotica

NOTA: I componenti chiave della pompa sono mostrati nella Figura 2A.

1. Determinare la profondità di inserimento della cannula per infusione cerebrale nel cervello. Assicurarsi che l'ago della cannula per infusione cerebrale utilizzata sia lungo 3 mm e che ogni distanziatore di regolazione della profondità sia di 0,5 mm. Per ottenere una profondità di iniezione di 1,5 mm (vicino al calloso), collegare tre distanziatori di regolazione della profondità all'ago della cannula per infusione cerebrale con adesivo tissutale (Figura 2B, C).
2. Per riempire la pompa osmotica, collegare l'ago della siringa fornito con la confezione della pompa a una siringa da 1 ml e aspirare il farmaco. Tenere la pompa in posizione verticale, inserire la siringa nell'apertura nella parte superiore della pompa e iniettare lentamente il farmaco, facendo attenzione a non creare bolle (vedere la Figura 2D). Quando il liquido fuoriesce dall'apertura, estrarre lentamente la siringa.
3. Rimuovere la flangia bianca dal regolatore di flusso con forbici o pinze, facendo attenzione a non piegare o schiacciare il moderatore di flusso. Quindi, inserire il moderatore di flusso nella pompa (Figura 2E). Per determinare se ci sono bolle nella pompa osmotica, pesare la pompa osmotica separatamente prima e dopo il riempimento.
4. Tagliare il catetere a una certa lunghezza in base alle dimensioni dell'animale (cateteri da 20-25 mm per topi P56 che pesano circa 25 g). Collegare il catetere alla cannula per infusione cerebrale.
5. Riempire il catetere con i farmaci utilizzando la siringa senza introdurre aria (Figura 2F).
6. Collegare il catetere al moderatore del flusso. Dopo l'inserimento, assicurarsi che il catetere copra circa 4 mm del moderatore di flusso esposto (Figura 2G).
7. Per garantire che la pompa osmotica possa funzionare immediatamente dopo l'impianto, immergere le pompe riempite in soluzione fisiologica sterile allo 0,9% o PBS a 37 °C per almeno 4-6 ore (preferibilmente prolungare durante la notte) per pre-bagnare la membrana semipermeabile sulla superficie della pompa con soluzioni che abbiano la stessa pressione osmotica dell'ambiente tissutale (Figura 2H).
8. Tutte le soluzioni caricate nelle pompe devono essere sterili. Le pompe ALZET sono fornite sterili, essendo state esposte a una dose sterilizzante di cobalto-60. Tuttavia, in caso di contaminazione esterna, la superficie della pompa può essere pulita strofinandola con alcol isopropilico (70% in acqua).

3. Impianto della pompa osmotica

1. Attendere 3 giorni dopo la definizione del modello di demielinizzazione del corpo calloso. Accendi il sistema di anestesia per piccoli animali. Disinfetta forbici, pinzette e pinze emostatiche e immergile in una soluzione alcolica al 75%. Stendere fogli sterili nell'area chirurgica.
2. Anestetizzare e fissare nuovamente i topi sull'apparato stereotassico. Coprire la superficie dei bulbi oculari con una pomata per evitare la secchezza.
3. Disinfettare la ferita originale con alcol al 75%. Aprire l'incisione chirurgica precedentemente suturata (Figura 3A) ed espandere l'incisione fino alle scapole (Figura 3B).
4. Separare la pelle dal tessuto connettivo sottocutaneo con una pinza emostatica o una pinzetta in corrispondenza della scapola per aprire una cavità (Figura 3C). Posizionare la pompa osmotica nella cavità (Figura 3D, E).
5. Con un batuffolo di cotone, strofinare delicatamente ed esporre il foro stenopeico sulla superficie del cranio creato durante la definizione del modello di demielinizzazione (vedere il passaggio 1.8). Inserire la cannula per infusione cerebrale attraverso questo foro stenopeico perpendicolarmente e fissarla rapidamente al cranio con adesivo per tessuti (Figura 3F).
6. Rimuovere la linguetta rimovibile sopra la cannula per infusione cerebrale con un paio di forbici (Figura 3G, H). In alternativa, rimuovere la linguetta prima di inserire la cannula per evitare di tremare durante questo processo.
7. Cucire l'incisione o fissarla con adesivo per fazzoletti (Figura 3I).
8. Dopo l'intervento chirurgico, posizionare il mouse su un termoforo per evitare un calo della temperatura corporea. Somministrare un'iniezione sottocutanea di 5 mg/kg di carprofene ogni 24 ore per alleviare il dolore. Applicare ogni giorno unguento all'eritromicina sull'incisione per assicurarsi che la ferita guarisca correttamente. Metti l'animale in una gabbia da solo e nutrilo con cibo umido fino a quando non si sarà completamente ripreso.

Risultati

Figura 1: Istituzione del modello murino di demielinizzazione indotta dalla lissolecitina. (A) Fissare il mouse nell'apparato stereotassico. (B) Aprire un'incisione sagittale centrale di 1 cm per esporre il cranio. (

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Pompa dell'aria per anestesia	RWD	R510-29	E05818-006
Kit per infusione cerebrale 3	ALZET	8851	1-3 mm
Carprofen	Macklin	C830557-1g	5 mg/kg ogni 24 h
Occhio di eritromicina unguento	lungo la tecnologia	YCKJ-RJ-024780	Coprire la superficie dei bulbi oculari durante l'anestesia
Unguento all'eritromicina	pythonbio	RG180
Apparecchio di evacuazione del gas	RWD	R546W	E05518-002
L-α-lisofosfatidilcolina	Sigma	L0906	Sciogliere all'1% con
siringa	Hamilton	65460-05	Serie di siringhe: 1700, 10 μL, 33 gauge
Pompa micro-osmotica modello 1002	ALZET	4317	0,25 μL all'ora, 14 giorni
PBS (pH = 7,3)	ORIGENE	ZLI-9061
Pentobarbital sodico	Shanghai Civi	CAS NO: 57-33-0	150-200 mg/kg iniezione intraperitoneale per eutanasia
Macchina per anestesia per piccoli animali	RWD	R520IE	E05807-006
M Apparecchiatura stereotassica	RWD	E06382
STERI 250 sterilizzatore	Keller	31101	Sterilizzazione rapida di strumenti chirurgici
Suture chirurgiche	Shanghai jinhuan	F504	5-0
Ago per siringa (1 mL)	Shanghai KDL	6930197811018	26 gauge (0,45 mm x 16 mm)
Test di farmaci e solventi	Dipendente dall'esperimento	N/A
Sistema di monitoraggio omeotermico Thermostar	RWD	69026	Mantenere la temperatura corporea durante l'anestesia
Adesivo tissutale Vetbond	3M	1469SB	Fissare la cannula per infusione cerebrale e far aderire l'incisione cutanea

sterile PBS Microliter